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1、第十二章动物细胞培养技术一 .思考题1. 动物细胞培养所用的培养基有几种类型？答：（ 1）天然培养基（2）合成培养基（3 ）无血清培养基2. 离体动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？答：不能，动物细胞的全能性随分化程度提高而受到限制，分化潜能变弱，所以动物细胞培养只能是细胞数目增多而不能发育成新的动物个体。二 . 练习题1、一般来说，动物细胞体外培养具有一定的生存期，而且细胞分裂次数也是有限的。（，）2、 分化程度高的比分化低的容易培养; 肿瘤组织比正常组织容易培养。（X）3、利用成纤维细胞比上皮细胞贴壁过程快，大部分成纤维细胞能在短时间内完成附着过程， 而上皮细胞在短时间
2、内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，以此差别来纯化细胞的方法称酶消化法。（X）4、在倒置显微镜下可看到动物细胞培养液中有纵横交错的丝状、管状和树枝状菌丝，可判定是已被细菌污染了。（X）5、中期阻断法是适于贴壁细胞的选择性同步化的方法（X）6、培养液由桃红色变为黄色，是由于 CO2积累过多，培养液发生酸化，需要及时调整pH,否则会对细胞发生不利影响，严重时细胞脱落发生死亡。（，）三、问答题1、在动物细胞培养中常添加血清，血清起到什么作用？答：血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要 为白蛋白和球蛋白。氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分， 其中有些氨基酸动物细胞本身不能合
3、成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子（如表 皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等）；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促 进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺 利生长和增殖，一般需添加 10%-20%勺血清，动物血清还可起到酸 碱度缓冲液的作用。或者答：血清在动物细胞培养中起着多方面的作用：提供细胞生存和增殖所必需的生长调节因子。补充基础培养基中没有或量不足 的营养成分。含有一些可供贴壁细胞型细胞贴壁生长的基质成分。提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。在一些情况下，中和毒
4、性物质保护细胞不受伤害。给培养液提供良好的缓冲系统。提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受死细胞释放的蛋白酶 的伤害。2、论述动物细胞同步化培养的主要方法及其技术原理 答：1、选择同步化法1）.有丝分裂选择法 这种方法主要是根据细胞周期的不同阶段 的生理变化设计的方法主要特点是可以获得一定数量的M期的同步化细胞，不受药物影响，同步化高，但获得细胞数量少、步骤多，且 只能是在贴壁细胞中可以用。2).细胞沉降分离法主要用于悬浮细胞， 其理论依据是细胞周期不同阶段的细胞体积不同， 因为细胞在某一离心力场中的沉降速度与其半径的平方成正比。细胞在进行分裂时， 细胞体积呈线性增加， 利用洗脱离心机可以将体积大小不
5、同的处于不同时期的分离开。 对分离收集的细胞进行测 量和分析，确定其时期。2、诱导同步化(1) .血清饥饿法-G0期细胞的获得取处于对数生长期的细胞,用含0.5%1%小牛血清的培养基培养细胞4872h， 或用无血清的培养基培养24h。 用 0.1%0.25%胰蛋白酶消化细胞可收获G0细胞，可用3H-TdR掺入进行测量鉴定。(2) .异亮氨酸营养缺乏法G1 期细胞的获得1) .将用 M 期阻断法获得的细胞加入一定量的培养基， 继续培养 110h即可获得各阶段的 G1 期细胞。2) .用缺乏异亮氨酸的培养基培养细胞，培养时间超过一个细胞周期，即可获得 G1 期细胞。3) ).DNA合成抑制剂阻断法
6、a.选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成，将细胞群阻断在S 期或G/S交界处。b.胸腺喀咤核甘(TdR双阻断法：利用过量TdR能阻断DNA合成的原 理而设计，为加强细胞同步化效果，常采用两次TdR阻断法即双阻断 法： 第一次阻断时间相当于G2、 M 和 G1 期时间的总和或稍长。 释放时间不短于S期，而小于G2+M+G1期时间，这样才能使所有位于G1/S 期的细胞通过S期，而又不使沿周期前进最快的细胞进入下一个S期。第二次阻断时间同第一次，再释放。4) ).秋水仙素阻断法中期阻断法常用秋水仙素来抑制微管聚合，将细胞阻断在有丝分裂中期。第十三章动物 细 胞 融 合一 . 问答题1. 仙台
7、病毒、PEG电融合的原理分别是怎样的？答：仙台病毒：仙台病毒囊膜上有许多具有凝血活性和唾液酸苷酶活性的刺突，它们可与细胞膜上的糖蛋白起作用，使细胞相互凝集，再通过膜上蛋白质分子的重新分布，使膜是脂类分子重排，从而打开质膜，导致细胞融合。PEG ： PEG 是最常用的诱融剂，带有负电荷，而且具有强烈的吸水性和凝聚和沉淀蛋白的作用， 可使细胞表面变得黏稠，细胞相互黏合、改变细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组， 产生穿孔， 最后发生融合。电融合：将亲本细胞置于交变电场中，使他们彼此靠近，紧密接触，并在两个电极间排列成串珠状，然后在高强度，短时程的直流脉冲作用下， 相互连接的两个或多
8、个细胞的质膜被击穿而导致细胞融合。2. 动物有几种淋巴细胞？其免疫方式哪几种？答：体液免疫（B淋巴细胞）和细胞免疫（T淋巴细胞）3. 植物细胞、动物细胞融合技术的区别？答：植物细胞、动物细胞融合技术的区别植物体细胞杂交要首先去掉细胞壁,而动物细胞不用；植物细胞分离用纤维素酶和果胶酶等,而动物细胞的分离要用胰蛋白酶或胶原酶等；植物细胞培养基有再生细胞壁过程,动物细胞没有；植物细胞融合诱导方法有物理和化学方法、而动物细胞诱导融合有物理、化学和生物方法；植物体细胞杂交能最后可以形成个体,而动物细胞融合能形成细胞系 ,并不能形成个体4、为什么要选用同一品系的小鼠骨髓瘤细胞与 B淋巴细胞融合？答： 因为
9、这样不仅能保证所得杂交瘤细胞的染色体的稳定，还能使其持续分泌特异性抗体。 而且这样的杂交融合率高， 也便于日后的杂交瘤细胞能够在同系动物中生长， 以便获得大量腹水制备单克隆抗体。6、简述鼠源性单抗在应用存在哪些局限性答：1）不能有效地激活人体中补体和Fc受体（对免疫球蛋白Fc部分 c 末端的受体）相关的效应系统。2）被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体（HAMA） 。3）在人体循环系统中很快被清除掉。5、为什么要对鼠源性单克隆抗体进行改造使之人源化？答：鼠源性单抗仍带有鼠抗原决定簇而使其应用存在一定的局限性：1、不能有效地激活人体中补体和Fc受体（对免疫球蛋白Fc部分c末端的受体）相关的效应系统。2、被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体（HAMA） 。3、在人体循环系统中很快被清除掉。因此，必须通过人源化改造获得低免疫原性、高效性、人源性单克隆抗体，解决鼠杂交瘤单抗用于人体的变态反应的问题。