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1、学号：071140208湖北民族学院本科毕业论文超声辅助提取川木通总黄酮的工艺研究院 系： 生物科学与技术学院 姓 名： 周 茜 专 业： 生物工程 指导教师： 刘晓鹏 中国恩施二一五年五月Std.ID: 071140121BACHELORS THESIS OF HUBEI UNITroloxRSITY FOR NATIONALITIESUltrasonic -assisted extraction of total Flavonoids from Caulis clematidis armandiMajor: Biological engineeringStu-Name: Qian Zhou
2、Mentor: Xiaopeng LiuEenshi chinaMay 6th, 2015郑重声明本人郑重声明所呈交的学位论文超声辅助提取川木通总黄酮的工艺研究是我在导师 刘晓鹏 的指导下独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖北民族学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确的方式进行了说明。本声明的法律结果由本人独自承担。 作者签名： 年 月 日超声辅助提取川木通总黄酮的工艺研究周茜（湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施，445000）摘要：本文
3、为对超提取川木通中黄酮类化合物的工艺进行优化，在提取率受乙醇浓度、料液比、超声时间、超声功率四个因素影响的研究中运用单因素试验及在其基础上进行的正交试验，得到提取川木通黄酮类化合物的最佳工艺。结果表明在室温条件下，最优工艺条件为：乙醇浓度90%，料液比1:30 g/mL，超声波工作时间8 min，超声波功率200 W。用一组3次重复的试验验证此条件，提取率取平均后为0.65%。与传统方法相比，该方法明显缩短了提取时间，提高了黄酮的提取率。该研究为川木通总黄酮的提取及工业化生产提供了实验基础。关键词：超声波；川木通；黄酮Ultrasonic -assisted extraction of tot
4、al Flavonoids from Caulis clematidis armandiQain Zhou(College of Biological Scientific and technical,Hubei Minzu University , Hubei Enshi, 445000)Abstract:In this paper, the process of ultrasonic -assisted extraction of total Flavonoids from Caulis clematidis armandi was optimized. Single factor exp
5、eriments were implemented to investigate the effects of ethanol concentration, solid-liquid ratio, ultrasonic working time, ultrasonic power, respectively, on the extraction rate of total Flavonoids from Caulis clematidis Aemandi. Othogonal testwas used to optimize the process.The results showed tha
6、t: At room temperature,the optimal experiment conditions was the concentration of ethanol is 90%,the solid-liquid ratio is 1:30 (g/mL),ultrasonic working time 8 min, ultrasonic power 200 W. The experiment was repeated three times under the optimal conditions ,average extraction rate was 0.646%.Compa
7、ring with traditional methods, this method significantly shortens the working time of ultrasonic, and improving the extraction rate.This study provides the experiment basis for commercial process.Keywoods：Ultrasonic; Caulis clematidis armandi; flavonoids目录摘要IAbstractII2 文献综述12.1 川木通12.1.1 川木通简介12.1.
8、2 川木通药理作用12.2 黄酮12.2.1 黄酮类化合物的分子结构22.2.2 黄酮类化合物的理化性质22.2.3 黄酮类化合物的药理作用22.2.4 黄酮类化合物的其他应用32.3 黄酮提取的原理与方法32.3.1 溶剂萃取法32.3.2 碱提取酸沉淀法32.3.3 酶解法42.3.4 超声波提取法42.4 立题依据和研究意义43 材料与方法43.1 实验材料43.1.1 实验原料43.1.2 实验试剂43.1.3 溶液配置53.1.4 实验仪器53.2 实验方法53.2.1 芦丁标准曲线的制作53.2.2 提取率的计算63.2.3 单因素实验63.2.4 正交实验73.2.5 数据处理7
9、4 实验结果84.1 芦丁标准曲线的制作84.2 单因素实验的结果84.3 正交试验结果104.4 验证试验结果105 讨论116 结论12参考文献13致谢15I1 文献综述1.1 川木通1.1.1 川木通简介 川木通，又名小木通、淮木通等， 因其产于四川而得名。川木通呈长圆柱形，略担曲，长为50l00 cm，直径为23.5 cm，切片厚24 mm。，川木通在中国药用历史上已有千年之久，在证类本草、本草纲目、天宝本草等书中均有记载。川木通主要含有三萜皂苷类、黄酮类、木脂素、多糖等活性成分。魏志奇1表示，目前已经报道的川木通中所含的黄酮类为二氢黄酮。1.1.2 川木通药理作用（1）利尿作用 川木
10、通作为利尿药使用已有几千年历史，是极为传统的药用植物。张雪松2的兔慢性利尿试验表明川木通有显著利尿效果。他们的试验方法是连续5天给兔的腹腔给以木通醇浸膏，从而得到该结果。（2）抗炎镇痛作用川木通中含有丰富的皂苷类化合物以及有机酸成分，具有抗炎镇痛的作用。由刘岩庭3等的研究可知川木通有抗炎效果。运用小鼠腹腔毛细血管通透法和小鼠耳肿胀法可得到，川木通中常春藤皂苷元对抗炎最有效，齐墩果酸也可以显著抑制二甲苯的致炎反应。（3）抗菌作用 川木通同时还具有抗菌作用，其作用机理是它具有一定的杀菌作用。唐远4乌兰其其格5的研究均表明表明川木通可杀灭金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌等细菌。1.2 黄酮黄酮类化合物泛指
11、由中央三碳将2个苯环联结起来的一系列化合物（C6-C3-C6）。因这类化合物多呈黄色或淡黄色而称黄酮。自然界中广泛存在着黄酮类化合物，植物组织中的糖能与很多黄酮类化合物结合，其大多数存在的形式是黄酮苷，少部分是游离态。它们有助于植物抵御异物的侵入，也有助于植物生长、发育、开花、结果。黄酮是天然酚类化合物之首6 。目前已超过4 000种的黄酮类类化合物被分离出来,国内外广泛关注其生理活性的多样性，研究进展迅速。1.2.1 黄酮类化合物的分子结构 黄酮类化合物的基本骨架（如图1.1）。根据三碳链氧化程度的不同、B环连接位置的不同以及三碳链的环化程度等特点,可被分为黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢
12、黄酮醇类、异黄酮类、二氢异黄酮类等不同类型。图1.1 黄酮类化合物的基本化学结构Fig1.1 Chemical constitutionof flavonoids1.2.2 黄酮类化合物的理化性质 黄酮类化合物大多数为结晶固体，少数为无定型粉末，多数呈黄色或淡黄色，可以测定熔点。结构和存在状态的不同在很大程度上影响着其溶解度，有以下一般规律：游离苷元易溶于稀碱和有机溶剂（如：乙醇、乙醚、乙酸乙酯等），几乎不溶于水；水、甲醇、乙醇等强极性的溶剂易于溶解黄酮苷类化合物，而苯、氯仿、石醚等有机溶剂难于溶解。此外，黄酮类化合物还能与部分试剂在一定条件下发生独特的显色反应，在早期，化学显色反应常在研究工
13、作中被用来判断黄酮类化合物是否存在以及以何种类型存在。1.2.3 黄酮类化合物的药理作用 黄酮类化合物能治疗多种人类疾病，具有抗炎、抗癌等诸多药理作用。（1）黄酮类化合物的抗炎免疫作用 黄酮类化合物能影响细胞有丝分裂，影响细胞细胞间的相互作用，因此具有抗炎免疫作用。王晓梅等7研究表明，黄酮类化合物可抑制NO、MDA和PGE2等的合成。同时通过他们的研究结果表明，黄酮对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀以及大鼠腹腔巨噬细胞 IL-1的生成有抑制作用。（2）黄酮类化合物对脑血管系统的影响 黄酮能修复血管内皮细胞的损伤，能溶解血栓，也能促进脑组织纤溶系统改善功能，黄酮类化合物有协同保护脑组织的作用。曹珊8等研究
14、表明：黄酮对脑缺血炎症及内皮血管的损伤有很好的疗效。（3）黄酮类化合物的抗癌作用黄酮类化合物的抗癌作用主要与其雌激素样作用、抑制酶的活性、诱导细胞凋亡等作用有关。研究表明，黄酮类化合物对乳腺癌、前列腺癌等均有预防和治疗作用9。1.2.4 黄酮类化合物的其他应用 黄酮类化合物的溶解特性很宽, 黄酮类化合物既有水溶性的, 又有脂溶性的。可据需要选择合适黄酮类化合物作为食品着色剂10。可在适当条件下黄酮类化合物中的二氢黄酮类化合物转化而成显甜味的二氢查尔酮糖苷，可作为天然的甜味剂。同时，工业上用的染料和抗氧化剂也曾使用过黄酮类化合物。1.3 黄酮提取的原理与方法 随着近十几年黄酮类化合物药用价值的不
15、断提升，它的提取显得尤为重要。下面简单介绍一下目前报道的黄酮类化合物的提取方法与原理。1.3.1 溶剂萃取法 仅限于提取黄酮苷类物质时，可用热水进行提取，如：自槐花米中提取芦丁。极性比较大的多糖黄酮苷，可以直接用沸水提取，但是沸水提取易产生较多易溶于水的杂质，需较复杂的后处理，且提取率也不理想，不常使用。极性较小的游离黄酮苷元则可用甲醇：水（1:1）连续萃取11。1.3.2 碱提取酸沉淀法 由于黄酮类化合物大多具有酚羟基，易溶于碱水中。可先用碱性的水或稀醇提取，提取液经酸化后可析出黄酮类化合物沉淀11。1.3.3 酶解法 当一些原料的细胞壁包围着黄酮类物质，使其不易被提取时，可以采用酶法提取
16、。如山楂中，黄酮被细胞壁所包围, 且细胞壁间有果胶粘结 , 采用酶提比一般方法提取率高 12。破坏果胶、纤维素等连接细胞壁的物质，使黄酮类物质得到充分释放是酶法提取原理。1.3.4 超声波提取法 用超声波法提取黄酮类物质，是目前比较新的方法 。它的原理是超声波产生的振动强烈、加速度高、空化作用强、以及搅拌作用有助于破坏细胞膜，利于释放与溶出黄酮类化合物。提取液在超声波作用下不断震荡，有利于溶质扩散。超声的热效应使水温基本在 57，对原料有水溶作用 12，超声提取不对提取物的结构、活性产生影响13。因此，超声波提取法作为一种快速、高效、节能的新型提取工艺，使原料的利用率和有效成分的提取率得到了很
17、大提高，提取时间大大缩短，并且避免了高温对提取成分的影响。1.4 立题依据和研究意义 目前 ,利用超声辅助提取川木通总黄酮的研究报道很少，本文采用正交法优化其条件，为以后川木通总黄酮的工业化生产提供实验基础 。 2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 实验原料 川木通购自湖北省金贵中药饮片公司，粉碎过60目筛，存于阴凉干燥处备用。2.1.2 实验试剂试剂名产地或供应商芦丁国药集团氢氧化钠天津市风船化学试剂科技有限公司硝酸铝天津市福晨化学试剂有限公司亚硝酸钠天津市福晨化学试剂有限公司2.1.3 溶液配置1 mol/L氢氧化钠称取4 g氢氧化钠于烧杯中，沸腾后冷却的蒸馏水溶解（除二氧化碳），移至
18、100 mL容量瓶中，定容至刻度线，摇匀贴上标签，备用，10%硝酸铝溶液称取10 g硝酸铝置于烧杯中，溶解，移至100 mL容量瓶中，定容至刻度线，摇匀，贴上标签，备用5%亚硝酸钠溶液称取5 g亚硝酸钠，放置于洗净烘干的烧杯中溶解，移至100 mL容量瓶中，定容至刻度线，摇匀，贴上标签，备用30%乙醇溶液量取16 mL的95%乙醇，放置于50 mL容量瓶中定容至刻度线，摇匀，贴上标签，备用其它浓度乙醇溶液按30%乙醇溶液步骤配置，现配现用2.1.4 实验仪器TU-1810 DSPC型紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司FA1004B电子天平上海精密科学仪器公司TDL80-2B型离心机
19、上海安亭科学仪器制造厂JY96-II超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司2.2 实验方法2.2.1 芦丁标准曲线的制作 称取芦丁0.038g，用30%乙醇溶解定容至250 mL（浓度为0.152 mg/mL，为初始浓度）制成芦丁标准液；往洗净烘干的25 mL容量瓶编号为的1、2、3、4、5，吸取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL的芦丁标准液分别放入相应容量瓶中，另外取蒸馏水做对照，编号为0号，各加入一定量的30%乙醇至总体积为12.5 mL；加入5%亚硫酸钠0.7 mL，摇匀，静置6分钟；加入10%硝酸铝0.7 mL，摇匀，静置6分钟；加入5 mL浓度为1 mol/L的氢氧化
20、钠，用30%乙醇定容至25 mL，静置15-20分钟，0号瓶调零，在510 nm下测各瓶的吸光值；以吸光度为纵坐标（Y），浓度（mg/mL）为横坐标（X），作芦丁标准曲线。2.2.2 提取率的计算 将测出的吸光度带入标曲，求得提取液中黄酮的浓度，按如下公式计算黄酮提取率： 式中：C是芦丁标准曲线计算出来的黄酮浓度 (mg/mL)； N为稀释倍数； V是提取液体积(mL)； M为川木通粉末质量(g)。 2.2.3 单因素实验（1）不同乙醇浓度对总黄酮提取率的影响 称取川木通0.5 g，共7份，用分别用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇作为提取液，按1:30 （g/mL）
21、的料液比进行超声提取，超声功率为200 W，超声波提取4 min，提取液在3000 r/min条件下离心30 min。取上清液，按照2.2.1步骤进行3个重复实验。川木通总黄酮的提取率根据2.2.2的方法计算,用来考察乙醇浓度对川木通总黄酮提取率的影响。（2）不同料液比对总黄酮提取率的影响 称取川木通0.5 g，共6份，用70%乙醇溶液作为提取液，分别按料液比为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 （g/mL）加入乙醇溶液，写好编号，在超声波200w的条件下提取4 min，提取液在3000r/min条件下离心30 min，取上清液，后续操作同2.2.3.1（不同乙醇浓度对
22、总黄酮提取率的影响），计算出提取率，以考察料液比对川木通总黄酮提取率的影响。（3）不同超声波功率对总黄酮提取率的影响 称取川木通0.5 g，共7份，用70%乙醇溶液作为提取液，按照1:30 （g/mL）的料液比添加乙醇溶液，超声波功率分别设定为50、100、150、200、250、300、350 mL，超声处理4 min，写好编号，提取液在3000 r/min条件下离心30分钟，取上清液，后续处理同2.2.3.1（不同乙醇浓度对总黄酮提取率的影响），计算出提取率，以考察超声功率对川木通总黄酮提取率的影响。（4）不同超声处理时间时间对总黄酮提取率的影响 称取川木通0.5 g，共5份，用70%乙醇
23、作业提取液，按1:30 （g/mL）的料液比添加乙醇溶液，在200 w超声波条件下分别用超声处理2、4、6、8、10 min，提取液在3000r/min条件下离心30 min，取上清液，后续处理同2.2.3.1（不同乙醇浓度对总黄酮提取率的影响），计算出提取率，以考察超声时间对川木通总黄酮提取率的影响。2.2.4 正交实验 为了确定超声波辅助提取川木通中黄酮的最佳条件，根据以上单因素实验的结果，选择4个因素中相对最优的3个条件，设置为3水平，采用L9(34)正交试验，确定的正交表如表2.1：表2.1正交试验因素与水平表Table2.1 Factor and levels of orthogon
24、al test水平A乙醇浓度/%B料液比/(g/mL)C超声波功率/WD超声波时间/min1791:1015062801:2020083901:30250102.2.5 数据处理 实验数据均用3组重复的平均数，用Excel软件进行统计分析。3 实验结果3.1 芦丁标准曲线的制作图3.1 芦丁标准曲线Fig3.1Standard curve of Sophorin 根据实验所得的芦丁浓度与吸光值的关系，建立了如下线性回归方程（图3.1），y = 10.201x +0.0026，相关系数R= 0.9998。3.2 单因素实验的结果（1）乙醇浓度对超声波辅助提取川木通总黄酮的影响图3.2 乙醇浓度总
25、对黄酮的提取率的影响Fig3.2 Effect of ethanol concentration on the extraction of total flavonoids fromCaulis clematidis armandi 由图3.2可知在，乙醇浓度对川木通总黄酮的提取率影响不大。提取率随着乙醇浓度升高而稳步上升且趋于平稳，在乙醇浓度达到80%时最高，当乙醇浓度超过80%后开始下降。所以选取的乙醇浓度70%、80%和90%作为后续正交试验的考察水平。（2）料液比对超声波辅助提取川木通总黄酮的影响图3.3 不同料液比对总黄酮提取率的影响Fig3.3 Effections of soli
26、d-liquid ratioon extraction of total flavonoids from Caulis clematidis armandi 由图3.3可知，黄酮提取率在不同料液比的条件下并没有太大区别，因此我们可以考虑，料液比对黄酮的提取率没有直接的影响。在选着正交实验条件时，为节约原料，我们选择料液比分别为1:10、1:20、1:30 g/mL作为后续正交试验的考察水平。（3）超声波功率对川木通总黄酮提取率的影响图3.4 不同超声波功率对黄酮提取率的影响Fig3.4 Effect of ultrasonic working time on extraction of tot
27、al flavonoids from Caulis clematidis armandi 由图3.4可知随着超声波功率的增大川木通总黄酮的提取率也增大，川木通总黄酮的提取率达到最高时超声波功率为200 W，之后川木通总黄酮的提取率随着超声波功率的继续增大又有所降低且逐渐趋于平稳，因此我们选取正交试验的超声波提取川木通中黄酮的超声波功率条件为150 w、200 w、250 w。 （4）超声波时间对川木通总黄酮提取率的影响图3.5 超声时间对川木通总黄酮提取率的影响Fig3.5 Effecton of ultrasonic power on extraction of total flavonoi
28、ds from Caulis clematidis armandi 由图3.5可知，川木通总黄酮提取率受超声时间的影响不明显。最大提取率在8 min时达到，超过8 min时又开始下降。所以正交试验选取超声波辅助提取川木通总黄酮的超声时间为6 min、8 min、10 min。3.3 正交试验结果 由表3.1得知，即料液比是影响川木通总黄酮提取率的最重要因素，其次分别是超声波提取时间、乙醇浓度、超声波功率。从平均提取得率K值来看, 最佳提取条件为A3B3C2D2，即提取溶剂为90%乙醇,1:30 （g/mL）的料液比，在超声波在200 W功率下工作8 min。3.4 验证试验结果 称取川木通0.
29、5 g，按料液比1:30 g/mL加入90%乙醇溶液，在超声波功率200W下超声波提取8 min,提取液在3000 r/min下离心30 min,准确吸取2 mL上清液转移至25 mL容量瓶中，按2.2.1中的方法进行实验，重复三次，按照2.2.2方法计算最后总黄酮的提取率。经计算得到川木通的总黄酮提取率为0.65%，通过优化，黄酮的提取率得到了显著的提高。表3.1 正交试验结果表Table3.1 Results of orthogonal test序号A乙醇浓度%B料液比g/mLC超声波功率WD超声波时间min提取率%111110.43212220.50313330.50421230.425
30、22110.40623320.51731320.51832130.49933210.51K11.4231.3681.4321.347K21.3341.3841.4331.519K31.4741.5191.4061.405R0.1400.1510.0270.1754 讨论 黄酮类化合物具有多种生理活性功能，在食品、药业等领域有非常广泛的应用。黄酮的主要作用均与其抗氧化活性有关14。随着黄酮类化合物研究的深入，提取黄酮的方法开始多样化。传统的方法有热水提法、碱性水或碱性稀醇提取、回流法、渗漉法等。新型提取技术有超声波提取法、酶解法等12。随着超声波技术的进步，超声处理黄酮的方法将越来越多15。超声
31、波方法相对于其他方法而言,超声波法明显优于传统的提取法， 它所用的提取时间大大缩短, 产率较高。 超声在低温下可强化水浸提取率，是提取黄酮的一种高效方法16。目前超声提取还停在实验室阶段， 其工业应用还有许多问题待解决17。随着超声技术的成熟，设备的不断改进，超声提取技术在食品、医药、化工等领域的应用前景将更广阔。目前，在国内外对川木通的研究报道，对川木通总黄酮提取工艺的研究更少，本论文采用超声波辅助提取法研究了提取川木通总黄酮的工艺条件，得到了一些可供参考的实验数据，可以为更好地开发和利用党参中黄酮类化合物提供一定理论依据。5 结论 从单因素实验可知：超声辅助提取川木通总黄酮的最优乙醇浓度是
32、90%，最优料液比是1:20 (g/mL)，最优超声波工作时间是6 min，最优超声波功率是350 W。从正交实验可得，超声辅助提取川木通总黄酮的其最佳为料液比1:30 (g/mL)，最优乙醇浓度为90%，最优超声功率为200 W，最优超声时间为8 min。提高了黄酮的提取率，且该提取率稳定，有利于川木通中黄酮的提取。14参考文献1 魏志奇.川木通化学成分及质量标准的研究D.成都中医药大学,2008.2 张雪松.木通药理活性成份及质量控制的研究D.吉林大学,2010.3 刘岩庭,侯雄军,谢月等.木通属植物化学成分及药理作用研究进展J.江西中医学院学报,2012,04(1):87-93.4 唐远
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37、会记住您的谆谆教诲且好好运用你所传授的知识，谢谢您。同时感谢重点实验室以及实验室的各位管理老师、员工和同学，有你们的帮助，我才能顺利完成毕业论文实验。感谢的是我的母校，是母校的培养才能成就现在的我，感谢我大学里所有的任课老师，因为有你们不辞辛苦地谆谆教诲，我才能在大学里提升自我，丰富自我。然后我庆幸在生物科学与技术学院遇到了周毅峰老师，一个及其负责任的班主任，一个改变我的人生轨迹的良师。周老师治学态度严谨，知识渊博；老师对工作的勤勉务实和做学问时的精益求精，这些都让我受益匪浅。老师带给我的不仅仅是专业知识的教诲，更有做学问的态度与方法，更有做人的道理。谢谢周老师对我的严格要求和不倦教诲！不论我站在什么位置，我最需要感谢的是我的父母，是他们二十几年来的培养和教诲，帮助我树立人生观和价值观，才让我能够走到这里，让我今后走得更远！相信以后会我会给你们幸福！我还要感谢我的朋友，感谢你们一路相伴相随，不抛弃不放弃，感谢你们一直以来对我的关系和照顾，让我度过了充实而愉快的大学生活！感恩生科院对我的栽培，感恩生科院各位领导、老师还有同学们从物质上和精神上给予我的支持和鼓励！