鸡新城疫血凝和血凝抑制实验.ppt

1、鸡新城疫的实验室诊断及免疫效果的评价目的目的1、掌握鸡新城疫的临诊要点。、掌握鸡新城疫的临诊要点。2、了了解解和和掌掌握握鸡鸡新新城城疫疫的的实实验验室室诊诊断断和和免疫监测技术。免疫监测技术。内容内容1、鸡新城疫的临诊要点。、鸡新城疫的临诊要点。2、鸡新城疫的实验室诊断。、鸡新城疫的实验室诊断。NDV的分离及鉴定；的分离及鉴定；NDV毒力的鉴定毒力的鉴定3、鸡新城疫的免疫效果评价、鸡新城疫的免疫效果评价鸡新城疫的免疫监测鸡新城疫的免疫监测血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)血凝试验（HA）和血凝抑制试验(HI)HA和HI的原理HA试验：许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞表面受体结

2、合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象。2.HI试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制，称HI试验。一、鸡新城疫的血凝试验(HA)【材料】【材料】新城疫病毒鸡胚接种尿囊液1份0.5鸡血球悬液1管生理盐水或PBS1瓶96孔微量血清盘1块微量加样器1支一、鸡新城疫的血凝试验(HA)【方法与步骤方法与步骤】（一）制备鸡红细胞悬液：（一）制备鸡红细胞悬液：1.用注射器抽取抗凝剂。2.用上述注射器，采用无菌法抽取健康的未免疫鸡的静脉血。3.混匀，加生理盐水适量，洗涤离心，共离心三次（第一、二次2000转/分5分钟、第三次3000转/分 5分钟）洗去血清及白细胞。取纯红细胞0.6m

3、l，加生理盐水稀释99.4ml，即成1%的鸡红细胞悬液。一、鸡新城疫的血凝试验(HA)（二）加样二）加样1.在在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50 L生理盐水。生理盐水。2.于左侧第于左侧第1孔加孔加50 L病毒液，混合均匀后，吸病毒液，混合均匀后，吸50 L至第至第2孔，依次倍比稀释至第孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃孔，吸弃50 L；第；第12孔为红细胞对照。孔为红细胞对照。3.自右至左依次向各孔加入自右至左依次向各孔加入0.5%鸡红细胞悬液鸡红细胞悬液50 L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。一、鸡新

4、城疫的血凝试验(HA)【病毒血凝试验的操作方法（单位：【病毒血凝试验的操作方法（单位：L）】）】孔 号123456789101112病毒稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照生理盐水505050505050505050505050病毒液5050505050505050505050 0.6%红细胞505050505050505050505050 微型振荡器1min，静置30min 弃50结果观察+-以以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位一、鸡新城疫的血

5、凝试验(HA)【结果判定结果判定】置于振荡器上振荡1分钟，静置后30 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100%凝集（+），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)【材料】除血球凝集试验所用材料外，血清取鸡免疫血清。鸡群卵黄抗体的制备鸡群卵黄抗体的制备1.1

6、取鸡蛋卵黄取鸡蛋卵黄20ml20ml，加入等量生理盐水，加入等量生理盐水，振荡，摇匀。振荡，摇匀。2.2.加入等量氯仿加入等量氯仿40ml40ml，振荡，振荡3030分钟。分钟。3.3.取振荡的卵黄液取振荡的卵黄液300030004000rpm304000rpm30分钟。分钟。4.4.取上清液作为抗体检测材料取上清液作为抗体检测材料二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)【方法】1.根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。2.在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，先在第1孔加50L生理盐水。3.自第3孔至12孔各加50L 4个血凝单位的新城疫病毒液。4.第孔加

7、被检鸡血清50L，吹吸混合均匀，吸50L至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50L，稀释度分别为：1:、1:4、1:8 ；第12孔加新城疫阳性血清50L，作为血清对照。振荡混合均匀，置室温中作用20min。5.自第l孔至12孔各加0.5%鸡红细胞悬液50L，振荡混合均匀，室温下静置30-40min后观察结果二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)孔号滴度lg2材料12345678910111212345678910病毒对照对照8单位病毒504单位病毒50505050505050505050生理盐水50被检鸡血清50505050505050505050弃500.6%红细胞505050505050505050505050震荡混匀，室温30-40min结果观察-+【病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：L）】以以100抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。效价。二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)【结果判定】以100抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。