2025年基孔肯雅热实验室检测技术方案.docx

1、2025年基孔肯雅热实验室检测技术方案依据基孔肯雅热防控技术指南（2025年版）及病原检测最新进展编制一、检测对象与标本管理规范1.1 检测对象分类 疑似病例：发病前12天内有流行区旅居史，且出现急性发热（38）伴皮疹或关节剧痛（以腕/踝关节压痛为特征）者。 临床诊断病例：疑似病例基础上血清特异性IgM抗体阳性。 重点筛查对象：o入境健康巾报有症状人员（发放就诊方便卡）oI/II类地区“登革热样病例”（体温38。C伴皮疹/关节痛且无呼吸道症状）。O聚集性疫情关联人群（同一地点14天内3例）。1.2 标本采集与转运表:基孔肯雅热检测标本类型及采集要求标本类型采集时机采集量处理要求保存条件急性期血

2、清发病1周内非抗凝血5ml4静置析出血清，3000rpm离心IOmin4保存S72h；-20短期；-70长期恢复期血清发病2-3周同急性期同急性期处理-70避免反复冻融全血/血浆发病S5天EDTA抗凝管3ml分离血浆需2h内完成-70保存，避免溶血伊蚊标本疫情暴发期成蚊及幼虫各20只75%乙醇浸泡固定4。C运输，-70。C保存转运要求：血清/血浆标本采用三重包装系统（主容器+吸水材料+硬质外包装），符合UN3373生物安全标准冰链维持2-8（常温运输需加入病毒保存液）附标本送检单注明发病日期、旅行史及初步症状二、检测方法与技术标准2.1 血清学检测检测原理与流程 IgM抗体检测：o方法：捕获E

3、LISA法（MaC-ELISA）、免疫层析法（胶体金）o窗口期：发病4天后检出，阳性提示急性感染o操作要点：避免类风湿因子干扰（建议ELISA法） IgG抗体检测：o方法：间接ELISA、免疫荧光法（IFA）O意义：恢复期阳性提示既往感染；确诊需恢复期较急性期滴度4倍升高2.2 病原学检测2.2.1 核酸检测（实时荧光RTPCR） 靶基因：病毒E1/E2结构蛋白编码区 引物探针序列（2025年更新版）：CHIKV-F:5,-TGGGCTTCGACATACCTCTG-3,CHIKV-R:5,-CCTTTGTGAAGCTGTTGGTG-3,CHiKV-P:Fam-Agcctgggctcatcgtc

4、aac-Bhqi 性能要求：O灵敏度S200copies/mL（达安基因、明德生物试剂已验证）O特异性：与登革热、寨卡病毒无交叉反应 结果判读：OCt值S37：阳性oCt值37-40：灰区（建议复测或测序确认）o阴性：无扩增曲线2.2.2 病毒分离细胞系：Vero（ATCCCCL-81）、C6/36（蚊源细胞）操作流程：1 .标本接种细胞monolayer2 .33（C6/36）或37（Vero）培养5-7天3 .观察细胞病变效应（CPE）：Vero细胞出现圆缩、脱落4 .免疫荧光法（IFA）鉴定病毒抗原适用范围：发病5天的高病毒载量样本（分离率80%）2.3病毒基因组测序2.3.1测序负略选

5、择平台类型代表设备适用场景技术参数短读长测序华大智造DNBSEQ-Ti+大规模溯源24h完成PE150,覆盖深度10x长读长测序CycloneSEQ快速入境筛查实时纳米孔测序，6h出初步结果靶向测序IlluminaiSeqlOO首例本地病例覆盖E2/E1基因突变热点区域2.3.2生信分析流程1 .数据质控：FaStQC剔除低质量序列（Q2090%）2 .基因组组装：SPAdeS拼接（覆盖度98%）3 .分型分析：构建系统发育树（参考株：东非型S27、亚洲型ECSA）4 .关键突变注释：E1-A226V（白纹伊蚊适应性突变）三、质量控制与生物安全3.1 质量保证体系室内质控：O每批次实验包含阴性

6、对照（PBS）、阳性对照（灭活病毒培养物）o临界值质控品（Ct值35-38）验证检测灵敏度室间比对：oI类地区每月参加中国疾控中心室间质评o使用复星医药、翌圣生物等商用质控品3.2 生物安全防护实验室等级要求： BSL-2：血清学检测、核酸提取前灭活处理 BSL-3：病毒分离培养、未经灭活样本的核酸提取职业暴露处置：1 .皮肤接触：立即用70%乙醇擦拭，0.5%次氯酸钠冲洗2 .锐器伤：挤出伤口血液，碘伏消毒，报告并监测体温14天3 .气溶胶泄漏：紫外照射30min,1%过氧乙酸喷雾四、结果报告与临床解释4.1 报告流程及时限 初筛阳性：1小时内电话报告属地疾控中心 最终报告：OPCR检测：收

7、样后6小时内OIgM检测：收样后12小时内o全基因组测序：收样后48小时内 网络直报：确诊病例24小时内录入“中国疾病预防控制信息系统”4.2 结果解释要点表:基孔肯雅飘实验室结果临床解读检测结果组合临床意义处置建议RT-PCR阳性急性期感染（病毒血症）立即防蚊隔离，启动疫点处置IgM阳性+IgG阴性急性期早期感染结合病程4天可临床诊断IgM阳性+IgG阳性近期感染（2-12周）补充恢复期血清抗体滴度IgG阳转或4倍升高确诊依据流行病学调查溯源病毒分离阳性确诊金标准毒株送国家病毒库保藏no特殊情形处理：核酸检测假阴性：发病7天病毒载量下降，建议抗体检测抗体窗口期：发病4天IgM未检出，需动态监

8、测五、检测技术新进展与应用5.1 快速检测平台微流控芯片技术：o明德生物“一管多检”试剂盒：同步检测登革热、寨卡病毒、基孔肯雅病毒o检测时间S70分钟，灵敏度98.2%5CRISPRCasl2a快速检测：O华大基因PTSeqTMPIUS系统：室温30分钟肉眼判读结果o适用于基层现场筛查5.2 自动化整合方案全流程系统：o翌圣生物AP-96N提取仪：20分钟完成96样本处理o复星诊断全自动PCR仪：60分钟输出结果5.3 质控品创新冻干球质控品(翌圣HifairLyO-Ready)：o37稳定性14天，适合野外移动实验室o含内标基因(RNaseP)监控提取效率六、应急处置与流程优化6.1 聚集性

9、疫情检测路径11类地区每300万人口1套PCR系统区域中心实验室共享平台50%社区中心11IW类地区省级CDC集中检测送国家实验室测序重点医院哨点注：I类地区需储备5000人份检测试剂（2025年佛山疫情经验）总结与展望本方案整合基孔肯雅热防控技术指南（2025年版）及最新实验室技术进展，突出三大核心理念：1 .精准分型o建立“快速筛查一靶向验证T全基因组溯源”三级检测体系OI类地区首例病例100%开展E1-A226V突变检测（白纹伊蚊适应性标志）2 .多病共防O推广登革热/基孔肯雅热/寨卡病毒联检试剂盒（明德生物等已上市产品）O蚊媒标本同步检测CHlKV与登革病毒3 .智慧监测O应用华大智造“测序-分析一体化”平台（CyClOneSEQ+DNBSeq-TI+）o海关入境样本实时测序，实现输入病例“关口前移”执行提示：各实验室应建立检测方法验证制度，新启用试剂需用10份阳性样本验证符合率90%2025年7月起，国家疾控中心每月发布毒株遗传进化分析报告，需及时调整引物设计以适应病毒变异。执行提示：各实验室应建立检测方法验证制度，新启用试剂需用10份阳性样本验证符合率290%。2025年7月起，国家疾控中心每月发布毒株遗传进化分析报告，需及时调整引物设计以适应病毒变异。