1、滋肾育胎丸在反复种植失败患者冻融胚胎移植中的临床疗效观察摘要目的探讨滋肾育胎丸在反复种植失败(repeatedimplantationfailure,RlF)患者冻融胚胎移植(frozen-thawedembryotransfer,FET)周期中的临床应用效果。方法采用回顾性病例对照研究，选取2017年10月至2023年4月期间于山东大学附属生殖医院女性生殖科就诊的RlF患者共744个周期,根据黄体支持是否加用滋肾育胎丸分为试验组(加用滋肾育胎丸，n=279)和对照组(不加用滋肾育胎丸，n=465),比较两组患者的妊娠结局。根据FET周期子宫内膜准备方案的不同，分为降调节方案(n=271)和非
2、降调节方案(n=473),比较每个方案中两组患者的妊娠结局。结果试验组和对照组患者的生化妊娠率、临床妊娠率、胚胎种植率、早期流产率、晚期流产率及活产率,差异均无统计学意义(均P005)降调节方案中试验组的生化妊娠率69.0%(58/84)、临床妊娠率59.5%(50/84)、胚胎种植率59.4%(57/96):明显高于对照组56.1%(105/187),P=O.045；46.5%(87/187),P=O.048；44.9%(92/205),P=O.019,差异均有统计学意义。在非降调节方案中，两组患者的妊娠结局差异均无统计学意义(均PX).05)。结论在FET降调节方案中，滋肾育胎丸可显著提高
3、RIF患者的临床妊娠率及胚胎种植率，改善妊娠结局。【关键词】妊娠结局；滋肾育胎丸；冻融胚胎移植；反复种植失败在生殖医学领域，辅助生殖技术(assistedreproductivetechnologies,ART)是治疗不孕症的重要手段。在ART周期中，采用控制性超促排卵方案，以获得多个胚胎用于冻融胚胎移植(frozen-thawedembryotransfer,FET)1o尽管全球各大生殖中心都采取各种措施提高体外受精-胚胎移植(invitrofertilizationandembryotransfer,IVF-ET)的临床妊娠率和活产率2,但遗憾的是，仍有部分患者进行了多个ART治疗周期后，
4、仍未能获得临床妊娠。反复种植失败(repeatedimplantationfailure,RIF)引起了国内外生殖专家的广泛关注。RIF发生率为10%15%,具体病因尚不明确，是临床治疗中面临的一大难题，给患者造成了很大的心理压力及经济负担3。RIF的具体定义尚未统一，2023年欧洲人类生殖与胚胎学会提出了个体化定义RIF,建议对多次移植胚胎预估累积妊娠率超过60%仍未妊娠进行RIF相关干预4。本文结合本中心的临床工作实践，将RIF定义为患者在至少2个移植周期中，每次移植2枚优质胚胎，仍未获得临床妊娠。胚胎植入是一个复杂的过程，与胚胎质量、子宫内膜容受性等密切相关5。研究表明，胚胎与子宫内膜的
5、同步发育在胚胎种植过程中起着非常重要的作用，在部分不孕症患者中，虽然移植了优质胚胎，但出现反复胚胎植入失败，表明子宫内膜容受性和胚胎与子宫内膜的同步性存在显著差异6,尤其在子宫内膜异位症患者中，因其子宫内膜可能存在缺陷，对胚胎的接受能力下降，容易引起胚胎种植失败7-9。为了改善子宫内膜容受性，临床医师采用了多种干预措施作为辅助治疗手段，包括补充雌二醇、血管生成调节剂、抗氧化剂、免疫调节剂、宫腔灌注粒细胞集落刺激因子、人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin,hCG)、自体富血小板血浆等10-11。然而，这些治疗效果尚存在争议。越来越多研究表明，中医药可以促进子宫
6、内膜的发育，改善子宫内膜的容受性，从而来改善RlF患者的临床结局12-16。滋肾育胎丸是一种传统的中药制剂，用于中医辨证为脾肾两虚的患者，具有调经、助孕、安胎三大功效17,在临床上广泛用于预防流产、加强黄体功能、调节月经紊乱，改善卵巢功能等方面，近年来有研究表明滋肾育胎丸能够改善子宫内膜容受性18,提高临床妊娠率、活产率19。但是滋肾育胎丸在RlF患者中的作用尚不明确，相关文献报道较少。本研究通过对RIF患者的FET周期进行回顾性分析，探讨滋肾育胎丸对RIF患者妊娠结局的影响，以期为RlF治疗提供新的思路。资料与方法一.研究对象本研究为回顾性病例对照研究，分析2017年10月至2023年4月期
7、间于山东大学附属生殖医院女性生殖科行FET的RlF患者的临床资料，根据子宫内膜转化日是否加用滋肾育胎丸分为试验组和对照组。根据FET子宫内膜准备方案又分为降调节方案和非降调节方案，比较每个方案中两组患者的妊娠结局。纳入标准：年龄2242岁；结合本中心的临床工作实践35岁以下临床妊娠率为61.42%,3537岁临床妊娠率为53.66%,3839岁临床妊娠率为45.02%,4042岁临床妊娠率为22.54%,胚胎植入前遗传学检测(preimplantationgenetictesting,PGT)临床妊娠率为63.0%,纳入年龄W39岁或者针对染色体非整倍体行PGT,既往移植次数N2次；年龄404
8、2岁，既往移植次数24次，预估累积妊娠率超过60%但仍未获得临床妊娠4；移植复苏后的优质囊胚2枚；黄体转化日子宫内膜厚度不小于7mm；中医辨证为脾肾两虚的患者；患者因输卵管因素、子宫内膜异位症、男方因素、排卵障碍、不明原因性不孕行体外助孕者。子宫内膜异位症患者根据妇产科学第9版中子宫内膜异位症的诊断标准，纳入腹腔镜或者阴道超声证实的子宫内膜异位症的患者7o排除标准：既往已诊断为重度宫腔粘连、子宫畸形的患者；因染色体异常、复发性流产、单基因病等原因需行PGT的患者；既往曾行影像学检查提示存在输卵管积水，但未处理的患者。本研究经山东大学附属生殖医院生殖医学伦理委员会批准(2024伦理字(124)号
9、)O二.研究方法1 .子宫内膜准备：纳入的FET周期采用了降调节方案和非降调节方案。（1）非降调节方案：主要包括自然周期、促排卵周期、激素替代周期。自然周期：月经周期规律的患者，于月经周期的第810天，B超监测卵泡动态发育过程及子宫内膜状态。排卵后第1天开始给予口服地屈孕酮片（达芙通，荷兰雅培）30mgd,排卵后第5天行FET,移植后12d如未妊娠者则停药，如妊娠者继续服药至10周左右逐渐减药至停药。促排卵周期：在月经周期的第25天给予促排卵治疗，排卵后Id给予黄体支持，用药方案同自然周期。激素替代周期：在月经周期的第25天，采用递增法口服戊酸雌二醇（补佳乐，德国拜尔制药），初始剂量为46mg
10、d,必要时可调整至最大剂量8mgd,密切监测子宫内膜厚度及血清中黄体生成素（luteinizinghormone,LH）、雌二醇、孕酮的浓度,当子宫内膜厚度27mm,且雌激素治疗持续时间不少于10d,若血清雌二醇水平超过100ng/L进行子宫内膜转化,给予口服地屈孕酮片20mg次，bid,联合使用阴道给药的微粒化黄体酮软胶囊（安琪坦，法国法杏大药厂生产）200mg/do在子宫内膜转化后第5天，行FET。（2）降调节方案：在月经周期第4天予肌内注射促性腺激素释放激素激动齐Il（gonadotropin-releasinghormoneagonist,GnRH-a,注射用醋酸亮丙瑞林微球，贝依注射
11、液，上海丽珠医药）3.75mg,2830d后检测体内血清卵泡刺激素（folIicle-StinlUIatinghormone,FSH）、LH,雌二醇水平，并行B超检查。在达到垂体降调节的标准（即FSH、LH均5U/L,雌二醇50ngL）后给予雌激素准备子宫内膜，用药方案及黄体支持方案同激素替代周期。试验组：子宫内膜准备方案同对照组，黄体支持用药在对照组的基础上黄体转化日同时加用口服滋肾育胎丸（广州白云山中一药业，国药准字Z44020008）5g/次，tid,移植12d若未妊娠则停药，若妊娠则继续服药至孕10周左右逐渐停药。2 .复苏囊胚移植评判标准：囊胚评分标准是根据Gardnen评分标准20
12、具体评分方法参考既往文献21o本中心评分24Be囊胚定义为优质囊胚，所有移植的胚胎均为优质囊胚。3 .观察指标：主要观察指标为活产率（获得活产的周期数/移植周期数XIo0%）。次要观察指标主要包括生化妊娠率（生化妊娠周期数/移植周期数Xlo0%）、临床妊娠率（临床妊娠周期数/移植周期数X100%）、胚胎种植率（孕囊数/移植胚胎数又100%）、早期流产率（孕12周内自然流产周期数/临床妊娠周期数Xlo0%）、晚期流产率（孕1228周自然流产周期数/临床妊娠周期数X100%）。不同妊娠结局指标的定义参考既往文献21o三.统计学方法采用SPSS22.0统计学软件进行数据分析。对计量资料采用t检验或
13、者直方图（近似正态分布）确定是否符合正态性分布。符合正态分布的计量资料用均数土标准差（xs）表示，采用t检验或校正t检验行组间比较。计数资料以率或构成比（）表示，采用PearsonX2检验或连续性校正的X2检验或Fisher确切概率法。对基线有差异和可能影响妊娠结局的因素进行logistic回归分析。P0.05为差异有统计学意义。结果一.两组患者基础资料比较本研究共纳入744个周期，其中试验组279个周期，对照组465个周期，试验组的优质囊胚数、既往移植周期数均少于对照组，用药方案的差异有统计学意义（均P（0.05）,两组患者的其余基础资料差异均无统计学意义（均PX）.05）,详见表1。表1两
14、组反复种植失败患者基础资料比较Table 1 ComparisonofbaselinedataofpatientswithRlFlxtweenthetwogroups项目IleMn试赞组(”279)Experimentalgroup对照组(n=465)ConlroIgroup收值i2value。值Pvalue女方年龄(岁Femaleage(year)32.993.6932.833.86().530.599体质fit指数(kgm2,xi)BMI23.483.4223233.480.960.339不孕年限(.x)Durationofinfertility(year)3552.473.682.620
15、700.485卵泡剌激素（UL,m）FSH6301.756.221.750.620.534黄体生成素（UL.*tCLH5.993.346.073.650.320.757雌二醇(ngLx5)E237.32I5.I239.I814.O71.680.093抗苗勒管激素（gL*CAMH5.543.895.793.980.860.389不孕类型(骚)TypesofIiiferlilily1.380.240原发不孕PriInaryinftBrliIiIy44.8(125/279)49.2(229/465)继发不孕StMpndaryinft4Ftilily不孕原因(%)Causesofinfertilit
16、y55.2(154/279)50.8(236/465)1.130.769输卵管因素Tubalfactor563(157/279)52.9(246/465)子宫内膜异位症Endometriosis18.3(51/279)19.1(89/465)男方因素Malefactor11.1(31/279)13.3(62/465)其他因索Otherfactors内膜准备方案()Theendometrialpreparationprotocols14.3(40/279)14.7(68/465)7.690.006非降调节方案Non-lowr-reglate!protocol69.9(195/279)59.8(2
17、78/465)降调节方案Down-negulatelcl30.1(84/279)40.2(187/465)转化“内膜厚度(rm,fs)Endry63.4(177/279)62.2(289/465)第6天Day6embryo36.6(102/279)37.8(176/279)本周期移植胚胎数(个,Es)Nu.ofetnlnhIransferrrclinthiscycle1.I5O.35I.I2O.331.020.309移植囊胚数(个%)lumberMtrasferrrlblastocysts185.3(238/279)88.0(409/465)1.080.298214.7(41/279)12.0
18、56/465)取卵周期数(个x)No.ofoocyteretrieval*yclesL09034l.110.400.850.394优质囊胚数(个xs)No.Ofhigh-qualityBlastocysts5.752.406.282.6l2.820.0()5既往移植周期数(个.x)Ne.ofprevioustransferryde2.49O.722.63O.892.310.021注：括号中示阳性数/总数丁示其他因索包括排卵障碍、不明原因性不孕、les:)OSiIiVenubrr/totalnumberinbrackets;representoilierfactorsincludeovulat
19、orydisordersandunexplainedinfertility二.两组患者妊娠结局的比较及logistic回归分析两组患者的生化妊娠率、临床妊娠率、胚胎种植率、早期流产率、晚期流产率、活产率等差异均无统计学意义(均P005,表2)ologistic回归结果显示，调整FET方案、优质囊胚数、既往移植周期数、年龄后，两组间临床结局差异均无统计学意义(均P0.05,表2)。表2两组反宓种植失败患者临床结局比较及kgi沁回归分析(%)Table 2 ComparisonofclinicaloutcomesofpatientswithRlFHndlogisticregressionanaly
20、sisl)etweenthehvogroups项目Item试验组(=279)Experimentalgroup对组(=465)Controlgroup/值2valueP值Pvalue()R(95%Cl)aP值aPvalueaO(95%Cl)生化妊娠率BioChemirHlpregnancyrate60.9(170/279)57.0(265/465)1.110.2911.18(0.87-1.59)0.1521.26(0.921.73)唧在妊娠率Clinicalpregnancyrate52.0(145/279)48.0(223/465)1.120.2891.17(087L58)0.1791.24
21、0.91-1.69)胚胎种坦率Enb11,oImplanlaliofirale51.2(164/320)46.1(240/521)2.140.144/早期流产挈Earlyabortionrate82(23/279)6.9(32/465)0.470.4921.18(0.702.12)0.2401.37(0.812.30)晚期流产于Lateabortionrate2.2(6/279)1.5(7/465)0.420.5181.44(0.48-432)0.4181.27(0.712.25)环产学Livebirthrah,41.6(116/279)39.6(184/465)().290.5891.09
22、0.80l.47)0.3261.77(0.575.51)注：lCMir回归调整因索包括kEr方案、优质囊胚数、既往移植周期数、年龄;7”示无;括号中东阳性数/总数Motes:logisticregressionadjustingfactorsincludedFETprotocol,numberofhigh-qualityblastocysts,numberofprevioustransfercyclesandage;,711representsnnt;xsitivenunl)erlotalnumberinl)rackets三.不同内膜准备方案中两组患者妊娠结局比较及logistic回归分析本
23、研究中降调节方案共271个周期，非降调节方案473个周期。在降调节方案中，患者以子宫内膜异位症居多，试验组的生化妊娠率69.0%(58/84)、胚胎种植率59.4%(57/96)、临床妊娠率59.5%(50/84)明显高于对照组56.1%(105/187),P=O.045；44.9%(92/205),P=O.019；46.5%(87/187),P=O.048,差异均有统计学意义。对妊娠结局进行logistic回归分析，调整优质囊胚数、既往移植周期数、年龄后，试验组与对照组的生化妊娠率、临床妊娠率差异仍均有统计学意义(均P0.05),详见表3。表3不同内膜准备方案中两组反豆种植失败患者不孕原因及
24、临床结局比较及IogiStiC回归分析()Table3AnalySiSofinfertilitycausesandclinicaloutcomesbetweentwogroupsofRIFpatientsunderdiffrenlendometrialprepa-rationprotocolsandlogisticregressionanalysis项目Itrm非降调节方案Non-clown-regulatedprotocol(=473)降调节方案Down-regulatedproto(0.905.68)晚期流产产LateabortionrateLO(2/195)1.4(4/278)0.160
25、6934.7(4/84)1.6(3/187)2.100.2080.0864.01(O.8219.58)活产率Livebirthrale41.0(80/195)39.9(111/278)0.060.81142.9(36/84)39.0(73/187)0.350.5530.6171.15(0.671.97)注：logi*i,回In调整因素包括优质囊胚数、既往移植周期数、年龄；示无；括号中示阳性数/总数Notes:Iugistieregressionadjustingfactorsincludednumberofligh-qualilyblaslrrinbrackets讨论在ART中，RIF是一个
26、极具挑战性的问题。RlF病因复杂，大致可以归为两类：母体原因（如子宫解剖异常、子宫内膜问题、免疫因素等）和胚胎原因（遗传缺陷和其他特定于胚胎发育的因素），其中2/3与母体因素有关，1/3与胚胎质量有关22o如何提高RlF患者的成功率是近年来关注的重点，子宫内膜容受性和胚胎质量是影响胚胎移植成功的关键因素。然而，在临床工作中，部分患者虽然移植了高质量的胚胎但RIF也时有发生，这使得子宫内膜的容受性成为关键因素。子宫内膜容受性直接影响胚胎能否顺利在宫腔内完成定位、附着及着床等一系列复杂过程。子宫内膜容受性的影响因素众多，包括解剖因素（先天性子宫畸形、子宫内膜息肉、宫腔粘连、子宫肌瘤）、免疫因素（慢
27、性子宫内膜炎）、代谢因素和内分泌因素2110在IVF-ET周期中，评估子宫内膜容受性的指标主要包括子宫内膜厚度、子宫内膜类型、子宫内膜血流分布情况以及搏动指数Cpulsatilityindex,PI）和阻力指数（resistanceindex,RI）等，这些因素均是影响临床妊娠结局的重要因素24-25。随着研究的不断深入，不少学者发现，中医药在改善子宫内膜容受性方面表现出了巨大潜力。赵珂等26的研究表明，补肾调轴方可以改善IVF-ET移植失败者或子宫内膜薄而取消移植者的子宫内膜厚度、增加子宫内膜血流灌注，改善子宫内膜形态，提高子宫内膜容受性，有助于提高临床妊娠率。动物实验中，调经促孕方能促进子
28、宫内膜组织双调蛋白与子宫内膜表皮生长因子受体结合，增加子宫内膜间质内血管、腺体、饱饮突的数量，提高饱饮突成熟度，改善胚胎着床障碍性小鼠的子宫内膜容受性，增加胚胎着床点数27o杜惠兰教授采用中医药介入IVF-ET的各个环节，以补肾填精为主、辅以调补冲任进行治疗，可有效提高子宫内膜容受性，提高RlF患者的成功率28。补肾活血疗法可以调节自然杀伤细胞与免疫系统，促进滋养细胞生长,降低肿瘤坏死因子-a,动态平衡Thl/Th2优化子宫内膜微环境，增加子宫血流灌注，改善子宫内膜容受性，提高RlF患者的胚胎着床率29a滋肾育胎丸是罗元恺教授的经验方，是一种中药制剂，由菟丝子（盐水制）、砂仁、熟地黄、人参、桑
29、寄生、阿胶珠、制何首乌、艾叶、盐巴戟天、白术、党参、鹿角霜、枸杞子、续断、杜仲组成，具有健脾补肾、益气养血安胎的功效，近年来被广泛应用于改善生殖功能30o有研究显示，滋肾育胎丸可使RlF患者的子宫内膜厚度显著增加，提高血清中孕激素水平，使血清中的雌激素与孕激素比值显著下降，子宫动脉的血流阻力指标Pl和Rl均明显降低，进而改善子宫内膜容受性31o现代药理学的研究显示，滋肾育胎丸中的巴戟天和菟丝子能够显著增加血管内皮细胞生长因子的表达及其受体的数量，促进血管生成，提高血流灌注，改善子宫内膜容受性32o菟丝子含有黄酮类物质，能够促进滋养细胞的生长，抑制细胞凋亡,有助于提高胚胎种植率，降低流产风险33
30、o桑寄生具有类似雌激素样作用，能够影响下丘脑-垂体-性腺轴，增加子宫内膜厚度，同时可以抑制子宫收缩，减少子宫内膜蠕动波的频率，提高胚胎种植率34o续断具有类似孕激素的活性，可以增加子宫内膜孕酮受体表达，提高孕激素水平，同时可以促进子宫内膜蜕膜化，有助于胚胎的植入35o白术通过上调转化生长因子-Bl抑制ThI7细胞的表达水平来改善子宫免疫微环境，维持母-胎界面的免疫平衡，从而改善妊娠结局36o本研究结果显示，在降调节方案中，对RIF患者进行常规黄体支持的基础上加用滋肾育胎丸，胚胎种植率、临床妊娠率均明显高于对照组。目前滋肾育胎丸广泛应用于ART治疗中，有研究显示，滋肾育胎丸可增加体外助孕患者子宫
31、内膜厚度，通过对雌孕激素的调节来改善子宫内膜容受性，为胚胎的着床创造更有利的环境，从而提高临床妊娠率37-38。滋肾育胎丸能够显著提升血清孕酮水平，并伴随人类白细胞抗原-G表达增加、CD4/CD8比值及hCG、雌二醇水平升高,起到免疫调节的作用，进而改善妊娠结局39O2016年一项在IVF冷冻复苏胚胎移植周期中应用滋肾育胎丸的随机对照试验(randomizedcontrolledtrial,RCT)研究结果显示：滋肾育胎丸可以有效改善受试者在胚胎移植前的子宫内膜状况，为胚胎着床创造更有利的环境；对有流产史的患者，能够显著提升其FET后的临床妊娠率；对于RIF患者滋肾育胎丸组的临床妊娠率有明显升
32、高的趋势，滋肾育胎丸可改善RlF患者的子宫内膜环境，对提高临床妊娠率起到积极作用40,与本研究结果一致。且既往研究显示，滋肾育胎丸安全性好41oRlF患者在FET周期中滋肾育胎丸联合宫腔灌注粒细胞刺激因子治疗，可明显提高转化日子宫内膜容积、子宫内膜血管指数、血流指数、血管血流指数，进而改善内膜血流，提高胚胎种植率，对临床妊娠率及活产率也有改善作用42o既往研究显示，在IVF周期中对于有过生化妊娠流产的患者，滋肾育胎丸可显著提高子宫内膜厚度，改善子宫内膜容受性，改善子宫内环境，达到补冲任、固滑胎的目的，降低流产发生率，使妊娠得以继续维持431o本研究结果显示，在降调节方案中试验组临床妊娠率及胚胎
33、种植率明显高于对照组。该组患者以子宫内膜异位症居多，国医大师肖承馀认为子宫内膜异位症的主要病机为肾阳不足、寒凝血瘀，而滋肾育胎丸具有补肾温阳、补血益气安胎之功效，因此在黄体期加用滋肾育胎丸可以温阳散寒，助孕安胎44。降调节主要通过GnRH-a与子宫内膜中的GnRH受体结合后，调节基因表达、蛋白组学等途径，干扰转化生长因子B(transforminggrowthfactorBeta,TGF-B)受体信号转导，影响子宫内膜TGF-B的分泌，激活局部血管活性因子，减少子宫内膜下的血流阻力，改善子宫内膜胞饮突的发育、内膜下血流灌注以及子宫内膜厚度，从而提高子宫内膜对胚胎的接受能力,提高临床妊娠率45-48。而滋肾育胎丸也可通过TGF-B信号通路影响细胞凋亡，提高卵巢储备功能49-50。其作用机制可能是二者联合用药能够产生药物协同作用，调节雌激素、孕激素水平，纠正患者内分泌激素紊乱，提高胞饮突成熟度，调控TGF-B信号通路，降低子宫动脉血流阻力，改善子宫内膜容受性，从而改善妊娠结局。但是，由于本研究为回顾性分析，且样本量相对偏小，所以研究结果可能会存在一定的偏倚，在今后的研究中，尚需扩大样本量或开展多中心联合的前瞻性RCT研究进一步探讨。综上，在RIF患者FET降调节方案中，加用滋肾育胎丸可以改善子宫内膜容受性，提高临床妊娠率及胚胎种植率，改善妊娠结局。
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