1、微生物药物发酵过程微生物药物发酵过程福建省微生物研究所福建省微生物研究所周周 剑剑（副研究员（副研究员）2014.05.23沤淆蛹报涝奏袍裂坟氟吊乐蹦姬庙壮缚倪距灰慧棍捏叫拎盈讽绍苑招作琴微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺微生物药物工业生产的组成微生物药物工业生产的组成(原料药）原料药）发酵分离 菌种 菌种选育菌种分离纯化菌种制备保存 摇瓶种子制备罐上种子制备发酵生产 发酵液预处理 产物提取产物精制纯化微生物药物贮析腿莫己尔绪踊生囊领针鞠幻喷甩照湃厚墒杖果谎萨肝页僚急秉欧弹侵微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺（一）微生物药物工业生产菌种（一）微生物药物工业生产菌种l工业生产用菌株不
2、同于实验室研究菌株，不但工业生产用菌株不同于实验室研究菌株，不但要求其产物合成能力能够稳定的表达，还应追要求其产物合成能力能够稳定的表达，还应追求产量尽可能的高，作为目标产品的类似物尽求产量尽可能的高，作为目标产品的类似物尽可能的少，发酵产物尽可能的易于提取精制等。可能的少，发酵产物尽可能的易于提取精制等。l在工业生产中，需要对生产菌株不断的纯化、在工业生产中，需要对生产菌株不断的纯化、复壮和改良。复壮和改良。袭畔抬恨傍起皮劈声顷把引饭囱棋篱沏矗曝谎券早沟撵过遍串焙徽际昼郴微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺 工业生产菌株应满足的要求：工业生产菌株应满足的要求：能够产生较高浓度的目标产物；
3、能够产生较高浓度的目标产物；微生物药物工业发酵中高浓度产物一般是胞外产物；微生物药物工业发酵中高浓度产物一般是胞外产物；产物便于分离提取；产物便于分离提取；能利用易得廉价原料，如淀粉、糖蜜、甲醇和纤维素物能利用易得廉价原料，如淀粉、糖蜜、甲醇和纤维素物质等；质等；不致病，不产生内毒素；不致病，不产生内毒素；发热量低，需氧低，具备适中的发酵温度和细胞形态，发热量低，需氧低，具备适中的发酵温度和细胞形态，即发酵条件较温和；即发酵条件较温和；容易进行代谢调控。容易进行代谢调控。碾获韵骏扫厄痊忘徒蛔溯嗜署微火乞槽故者渔驱搐庄石欣踢滦球凋法湍戊微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺l菌种的选育菌种的选
4、育 1.寻找产生新化合物的菌种（略）寻找产生新化合物的菌种（略）2.现有微生物药物产生菌种的选育现有微生物药物产生菌种的选育 目的：目的：a.提高目标产物的产率水平，降低杂质组分含提高目标产物的产率水平，降低杂质组分含量量 b.提高菌种对工业化生产条件的适应力提高菌种对工业化生产条件的适应力 方法：方法：a.自然纯化选育自然纯化选育 b.传统诱变选育（紫外线、诱变剂、离子束）传统诱变选育（紫外线、诱变剂、离子束）c.代谢调控和条件模型选育代谢调控和条件模型选育 d.基因工程选育基因工程选育签肮刻半鸡洽泣民勇顶游烧姑炕寂缄燕境寐喷娄幽霞圈冕鹃仔诗绿埃叉螟微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺l
5、工业用菌种的分离纯化工业用菌种的分离纯化正常菌退化菌传代传代传代微生物遗传变异是绝对的变异是绝对的，稳定是相对稳定是相对的；退化性的变异是多数的，进化性的变异是少数的。不对工业用菌种加以分离纯化，剔除变异菌，那么通过传代的累积效应，退化变异菌种将占据种群遗传优势。最终导致生产水平的波动和下降。晚敷冉狙腥秋歉晰慰熊庇辖肮停窖输弃牲存卤拣种诛牡苔虹振哟膀伊评芳微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺l菌种分离纯化流程菌种分离纯化流程（例）保存菌种涂布平板点种平板斜面稀释涂布单菌落点种接斜面扩增生产能力鉴定斜面斜面婉狠汝癣臆急嵌景脱交棍箱采指椰三枢些乞趋父咏配汝你钎磅鳖苍遣胸剁微生物药物的发酵工艺微
6、生物药物的发酵工艺l菌种制备保存方式：菌种制备保存方式：1.短期制备保存短期制备保存 短期制备保存方式主要用于生产用菌种的扩增制备和短时保存。短期制备保存方式主要用于生产用菌种的扩增制备和短时保存。保证培养物能够短时的保存在常温或者冷藏条件下，随时应用保证培养物能够短时的保存在常温或者冷藏条件下，随时应用 于生产。于生产。主要包括：菌落平板主要包括：菌落平板 试管试管/茄子瓶斜面茄子瓶斜面 麸皮麸皮/米孢子培养物米孢子培养物 2.中长期制备保藏中长期制备保藏 中长期制备保存方式主要用于菌种中长期保存，保证菌种的遗中长期制备保存方式主要用于菌种中长期保存，保证菌种的遗 传特性和活力，保证生产菌种
7、有可靠来源。传特性和活力，保证生产菌种有可靠来源。主要包括：冷冻甘油管保藏主要包括：冷冻甘油管保藏 冷冻干燥管保藏冷冻干燥管保藏 液氮甘油管保藏液氮甘油管保藏 沙土沙土/石蜡管保藏石蜡管保藏 基本原则：低营养基本原则：低营养/干燥干燥/缺氧缺氧/低温低温/密密封封翱啮拦求涨猖毕独斜童胖珠绳阿黄耻喘坏镐扛淬促靴献扛枯隐杆炬磺棺且微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺（二）微生物药物发酵生产过程（二）微生物药物发酵生产过程l发酵生产流程概况生产菌种培养摇瓶种子培养一级种子 罐培养二级种子 罐培养发酵罐培养微生物药物的发酵生产包括种子培养和发酵生产两个阶段。种子培养阶段通过连续的扩增培养，获得足够
8、量健壮均一健壮均一的 种子投入发酵生产。发酵生产包括生长期和生产期，生长期仍以菌量的扩增为目的；当营养消耗等条件适宜后，微生物即开始产生目标产物，进入生产期。忌遇根旦邢岔聊兆杆嗓八为灶姨聋耙促磺厄臼醇衙掌褒锈冯照鸟孰酌策娠微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺l发酵种子培养过程发酵种子培养过程迟滞期对数期平台期衰亡期种子生长曲线种龄菌量种子的评价指标：1.生长健壮旺盛，移入下一级后能迅速生长，迟滞期短2.菌体稳定均一，生长同步性好3.菌体总量和生长密度适宜4.无杂菌污染靡甜逞亮巢藻惹缎恤舒系钦成温狱舅伞尤贪蛹吼嚏申焊晌撇蚌埠债无围芦微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺l发酵种子培养的调控
9、发酵种子培养的调控 1.培养基培养基 碳源、氮源、无机盐、生长因子是微生物生长的四大营养要素。碳源、氮源、无机盐、生长因子是微生物生长的四大营养要素。一般而言，种子配方中一般而言，种子配方中碳碳/氮比要求均衡氮比要求均衡，量以满足生长为宜，量以满足生长为宜，优质有机氮源要有一定比例。碳氮源种类选择上则必须了解菌种优质有机氮源要有一定比例。碳氮源种类选择上则必须了解菌种的利用能力，并配合考虑种龄种量和发酵配方中碳氮源组成。的利用能力，并配合考虑种龄种量和发酵配方中碳氮源组成。2.环境因素环境因素 影影响响菌菌种种生生理理活活性性的的因因素素包包括括了了温温度度、pH、溶溶氧氧、渗渗透透压压、离离
10、子子强强度度等等。不不同同的的菌菌种种都都有有着着其其最最适适应应的的范范围围，从从而而进进行行正正常常的的生生理理代代谢谢。所所有有上上述述因因素素的的选选择择在在种种子子阶阶段段都都应应以以菌菌种种的的生生长长最适条件来进行选择。最适条件来进行选择。3.种子级数的设计种子级数的设计 种子培养级数越多，培养周期越长，过程中可能出现的不稳定种子培养级数越多，培养周期越长，过程中可能出现的不稳定因素越多。在设备条件允许的情况下，应因素越多。在设备条件允许的情况下，应尽可能缩减种子培养级尽可能缩减种子培养级数数，提高每一级培养下菌体的扩增量，保证下一级需要。，提高每一级培养下菌体的扩增量，保证下一
11、级需要。刑迟喷休琢蛮娘跃费团啦伶众谜婪糯矩毡溯腆锁份连潍股梅建誊袄述焊圭微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺发酵生产流程发酵生产流程培养基投料溶解移入发酵罐定容调节灭菌前pH值高压蒸汽灭菌降温至培养温度种子液移入调节空气流量、搅拌速度、罐顶压至规定值，开始发酵泻器渔扔像掏阻伙颐近谓一蛹堵阻壬耸驯硼肝轩廖径傻表蝉展紫炕辟枪毗微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺发酵生长曲线发酵生长曲线迟滞期对数期平台期衰亡期发酵周期生长期生产期次生代谢发酵原理：次生代谢发酵原理：当微生物生长到一定阶段，由于营养减少和有害代谢物积累，使当微生物生长到一定阶段，由于营养减少和有害代谢物积累，使比生长速率下降趋
12、零。为了维持生存，微生物体触发有关次生代比生长速率下降趋零。为了维持生存，微生物体触发有关次生代谢基因，产生次生代谢物。以取得环境竞争优势，保存自身。谢基因，产生次生代谢物。以取得环境竞争优势，保存自身。颜郑略悔利造肌报抛耶喝雏秘孜琢慰促昔释仗蛙团误莹倘渺撬着慢企崎去微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺影响发酵的相关因素影响发酵的相关因素培养基培养基 1.碳源碳源 碳源用于提供微生物能量来源、构建细胞和形成产物。碳源包括碳源用于提供微生物能量来源、构建细胞和形成产物。碳源包括单糖、双糖、多糖、天然复合物、油脂、低级醇烃等，如葡萄糖、单糖、双糖、多糖、天然复合物、油脂、低级醇烃等，如葡萄糖、
13、蔗糖、淀粉、面粉、豆油、甘油等。当培养基中碳源达到蔗糖、淀粉、面粉、豆油、甘油等。当培养基中碳源达到5%以上就以上就形成高渗透压溶液，影响发酵。同时在一定浓度下碳源会阻遏产物形成高渗透压溶液，影响发酵。同时在一定浓度下碳源会阻遏产物合成酶，形成合成酶，形成碳分解代谢物阻遏碳分解代谢物阻遏。2.氮源氮源 氮源是微生物蛋白质和其他含氮有机物的来源，也参与形成含氮氮源是微生物蛋白质和其他含氮有机物的来源，也参与形成含氮产物。氮源包括产物。氮源包括无机氮源和有机氮源无机氮源和有机氮源，如氨盐、硝酸盐、玉米浆粉、，如氨盐、硝酸盐、玉米浆粉、蛋白胨等。无机氮中的铵离子及有机氮通过降解得到的铵离子也有蛋白胨
14、等。无机氮中的铵离子及有机氮通过降解得到的铵离子也有阻遏产物合成酶的性质。阻遏产物合成酶的性质。3.矿物盐矿物盐 磷酸盐、镁盐、钙盐是微生物能量代谢和生长的参与因素。锌、磷酸盐、镁盐、钙盐是微生物能量代谢和生长的参与因素。锌、铁、钼、钴等是微生物所需要的微量元素。碳酸钙可以调节发酵液铁、钼、钴等是微生物所需要的微量元素。碳酸钙可以调节发酵液pH，但盐浓度达到一定程度则成为生长抑制和产抗调节因素。，但盐浓度达到一定程度则成为生长抑制和产抗调节因素。辜显赚虎讹额遗赞束急弯纳陆喂匈诱浪龚俩滚钮桐朝省灸洲章寡下尺荆刚微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺 4.生长因子生长因子 许多微生物生长需要它们
15、所不能合成的许多微生物生长需要它们所不能合成的生长因子生长因子，如特殊氨，如特殊氨基酸、维生素、生物素、嘌呤等。一般在天然复合物（如酵母基酸、维生素、生物素、嘌呤等。一般在天然复合物（如酵母粉、玉米浆）中有存在，但有时也必须单独添加以保证需要。粉、玉米浆）中有存在，但有时也必须单独添加以保证需要。5.消泡剂消泡剂 发酵过程中，由于营养物分解代谢和菌体老化，加上发酵罐发酵过程中，由于营养物分解代谢和菌体老化，加上发酵罐内通气和搅拌效果，易导致泡末产生，造成溶氧不足和逃液等内通气和搅拌效果，易导致泡末产生，造成溶氧不足和逃液等问题。可通过问题。可通过消泡剂的添加控制泡末消泡剂的添加控制泡末。一般消
16、泡剂为高分子聚。一般消泡剂为高分子聚合物，如泡敌，聚乙二醇等。油类也具有类似效果，如豆油、合物，如泡敌，聚乙二醇等。油类也具有类似效果，如豆油、葵花子油等。葵花子油等。6.前体物质前体物质 次生代谢产物的合成往往需要特定化学结构物质作为反应起次生代谢产物的合成往往需要特定化学结构物质作为反应起始物。这些物质虽然也能够通过微生物代谢合成得到，但如果始物。这些物质虽然也能够通过微生物代谢合成得到，但如果予以人为添加则可以有效减少限制，促进产物合成。如青霉素予以人为添加则可以有效减少限制，促进产物合成。如青霉素发酵中添加苯乙酸，红霉素发酵中添加正丙醇，达托霉素发酵发酵中添加苯乙酸，红霉素发酵中添加正
17、丙醇，达托霉素发酵中添加癸酸，雷帕霉素、环孢菌素等添加特定氨基酸效价可以中添加癸酸，雷帕霉素、环孢菌素等添加特定氨基酸效价可以提高好几倍。提高好几倍。影响发酵的相关因素影响发酵的相关因素培养基培养基召狼叼刚饲摄着浇设陨矢去稿哗自菩驯断凸乙镀忠逃拍半必磋遭琢啡奴片微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺发酵工业中，一些常见前体物质发酵工业中，一些常见前体物质产品产品前体前体产品产品前体前体青霉素青霉素G青霉素青霉素V金霉素金霉素灰黄霉素灰黄霉素红霉素红霉素达托霉素达托霉素苯乙酸苯乙酸苯氧乙酸苯氧乙酸氯化物氯化物氯化物氯化物正丙醇正丙醇癸酸癸酸核黄素核黄素类胡萝卜素类胡萝卜素L-异亮氨酸异亮氨酸L
18、色氨酸色氨酸L-丝氨酸丝氨酸西索霉素西索霉素丙酸盐丙酸盐-紫罗酮紫罗酮-氨基丁酸氨基丁酸邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸甘氨酸甘氨酸蛋氨酸蛋氨酸卜瘩踊藐威拈恒兔求识年芽萌烧虽躬霉花种整偶肉旺罩邑促箕渭狸客束场微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺前体一般都有毒性，前体一般都有毒性，浓度度过大大对菌体的生菌体的生长不利不利 如苯乙酸，一般基如苯乙酸，一般基础料中料中仅仅添加添加0.07%，癸酸，癸酸必必须培养培养15h后加入。后加入。前体添加前体添加过多，容易引起多，容易引起挥发和氧化，分解等。和氧化，分解等。因此因此，前体在使用前体在使用过程中，常采用流加方法。程中，常采用流加方法。用法用法：前体
19、普遍采用流加的方法，：前体普遍采用流加的方法，流加有利于提高前体的流加有利于提高前体的转化率。化率。纹箕肋愧浙痰董且忙酞容盐摹时吠假岗樟戍冻藩手挥岛佛渍过楷庆们椎兴微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺产物促物促进剂是指那些非是指那些非细胞生胞生长所必所必须的的营养物，又非前养物，又非前体，但加入后却能提高体，但加入后却能提高产量的添加量的添加剂。产物促进剂开罢范矣孕孕指伏悠卓娩径割务骆耕旱烦闹滁咨虽掺悼刃咆刮粥完矫隆舶微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺 促促进剂提高提高产量的机制量的机制还不完全清楚，其原因是多方面不完全清楚，其原因是多方面的（机理不的（机理不详）。）。有些促有些促进
20、剂本身是本身是酶酶的的诱导物；物；有些促有些促进剂是表面活性是表面活性剂，可改善，可改善细胞的透性，改善胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促胞与氧的接触从而促进酶酶的分泌与生的分泌与生产；也有人也有人认为表面活性表面活性剂对酶酶的表面失活有保的表面失活有保护作用；作用；有些促有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。贱硅楚辆健荆鞭犊怂国岗屉剐骆搞狞垦垃逝观驳悍代骚桑恕维这故淖陪驰微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺l在发酵培养基设计中，一般先用合成成分鉴别特殊需要，在发酵培养基设计中，一般先用合成成分鉴别特殊需要，再转为天然培养基，以扩大生产。再转为
21、天然培养基，以扩大生产。l在发酵培养基成分选择是，除传统营养外，可选用各种在发酵培养基成分选择是，除传统营养外，可选用各种农副产品、工业副产品、废料等。农副产品、工业副产品、废料等。l开发天然培养基时，应考虑：开发天然培养基时，应考虑：l新选微生物及其工艺的特殊营养需求；新选微生物及其工艺的特殊营养需求；l为保持培养基成分稳定，改善储藏条件和加工条件；为保持培养基成分稳定，改善储藏条件和加工条件；l原料的性质及配制、灭菌、发酵条件对产物提取的影原料的性质及配制、灭菌、发酵条件对产物提取的影响；响；l培养基价格。培养基价格。发酵培养基设计发酵培养基设计允诅哼耻搅荚嫁挣赁劳刷剂坟千辆似骡彻康棍弃胡
22、钵谨榜滩埂恤弟揉尝发微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺培养基优化l（1）目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合）目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方。某一菌种的培养基配方。l（2）只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参）只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照他人所使用的比较适合某一类菌种、某一类产品发酵的照他人所使用的比较适合某一类菌种、某一类产品发酵的经验配经验配方。方。l（3）采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和）采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的
23、培养基。实验方法选择出较为适合的培养基。门梢梗始港印酵始遗闯靶腹其拥亦陈摧湾棘奄厩挟郭捐味坍酋叁放盅邓烙微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺培养基优化的基本原则l注意事项：注意事项：l（1）菌种特性，同化能力）菌种特性，同化能力l（2）合适的合适的C、N比。比。l（3）合适的快速利用碳源、氮源。）合适的快速利用碳源、氮源。l（4）合适的生理性酸性与碱性）合适的生理性酸性与碱性l（5）pH、离子强度等、离子强度等没有最好，只有更好没有最好，只有更好庞逾往租菩奄苔臂经凛助蔚辩砌毒脉坠肉厕帮裹签并滑纠丁瓣亲线漱咖欠微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺提高生提高生产率率降低物耗、能耗、三降低物
24、耗、能耗、三废排放排放提高提高发酵酵单位位缩短生短生产时间价廉的原料替代，降低成本价廉的原料替代，降低成本培培养养基基优化化目目标宾壬晾沏蹿魁具耽律祁短源摔耘祝掳苛悲狂剩纤悠抠斧霓批溺池扒颓腊泰微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺正交正交实验均匀均匀设计神神经网网络其他其他方法方法聚聚类分析分析响响应面面分析分析单因子因子实验成本成本发酵酵单位位方法方法结果果培养基优化的基本方法抖洽升荣我层切些许依眯奢核谍春融碗汞俺靡冰服堂跋禽琴荒绒蛆伪衍孟微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺影响发酵的相关因素影响发酵的相关因素培养条件培养条件 1.温度温度 温度影响温度影响微生物酶系的活力微生物酶系
25、的活力，这些酶分别决定微生物的初级代谢生长，这些酶分别决定微生物的初级代谢生长和次级代谢产抗。不同微生物菌种的生长温度不一样，而生长和产抗阶和次级代谢产抗。不同微生物菌种的生长温度不一样，而生长和产抗阶段的最适温度也有差异。发酵温度的设计要综合考虑能源消耗、发酵周段的最适温度也有差异。发酵温度的设计要综合考虑能源消耗、发酵周期、稳定培养和产率水平因素，必要时可考虑变温培养。期、稳定培养和产率水平因素，必要时可考虑变温培养。2.pH pH对微生物的影响，主要也是作用于酶。另外对营养利用和细胞结对微生物的影响，主要也是作用于酶。另外对营养利用和细胞结构也有重要影响。无控制的条件下，构也有重要影响。
26、无控制的条件下，pH 呈现如下变化规律。呈现如下变化规律。有机氮分解，形成大量NH4+NH4+消耗利用 碳源消耗产生有机酸菌体老化，进入鸟氨酸循环形成大量NH4+菌体二次生长耶异吼婆阅汗哗洁拂渤披卡禾拿彩枝佯手输幢管随妮吏毖杠泵契侮澎讲剿微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺影响发酵的相关因素影响发酵的相关因素培养条件培养条件 pH的调节首要在基础培养基的设计，如生理酸碱性物质的搭配、的调节首要在基础培养基的设计，如生理酸碱性物质的搭配、缓冲体系的设计等。另外可以加入外源性的酸碱物质调控，如盐酸、缓冲体系的设计等。另外可以加入外源性的酸碱物质调控，如盐酸、氨水等。在流补体系中，往往通过葡萄糖
27、和氨水的流加平衡氨水等。在流补体系中，往往通过葡萄糖和氨水的流加平衡pH，同，同时也兼具营养补充功能。时也兼具营养补充功能。3.氧的供应氧的供应 工业微生物大都为工业微生物大都为好氧微生物好氧微生物，氧的供应和利用影响初级生长和，氧的供应和利用影响初级生长和次级代谢。工业发酵中，将无菌空气通入培养基，通过搅拌桨分散气次级代谢。工业发酵中，将无菌空气通入培养基，通过搅拌桨分散气体以实现有效利用，同时维持一定罐顶压以增大氧的溶解度。体以实现有效利用，同时维持一定罐顶压以增大氧的溶解度。反映氧的供给和利用情况的数值包括：反映氧的供给和利用情况的数值包括：DO溶解氧、溶解氧、OUR摄氧率、摄氧率、Kl
28、a氧传递速率等，可通过溶氧电极、发酵尾气分析仪等获得。氧传递速率等，可通过溶氧电极、发酵尾气分析仪等获得。类似的，生长和产抗往往有不同的氧需求。通过调节通气量、搅类似的，生长和产抗往往有不同的氧需求。通过调节通气量、搅拌速率、罐压可以有效控制和保证氧的供给。而发酵拌速率、罐压可以有效控制和保证氧的供给。而发酵黏度黏度、泡沫泡沫等因等因素往往导致氧利用的恶化，需要警惕和控制。素往往导致氧利用的恶化，需要警惕和控制。来潦篱巴恤嘱狠欺槽接沽巴洪恤肪靴挤郊耕鹿逆携窟色个弯殃功氟份肢幌微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺影响发酵的相关因素影响发酵的相关因素培养条件培养条件 4.灭菌条件灭菌条件 发酵
29、罐和培养基灭菌是无菌培养的必要前提，同时也导致发酵罐和培养基灭菌是无菌培养的必要前提，同时也导致营养营养损失和毒性物质积累损失和毒性物质积累。因此对于敏感菌种往往需要对部分养分单。因此对于敏感菌种往往需要对部分养分单独灭菌，以降低影响。但是这些影响因素往往会成为控制生长、独灭菌，以降低影响。但是这些影响因素往往会成为控制生长、调节微生物产抗的必要因素。通过灭菌温度、时间的调整来控制调节微生物产抗的必要因素。通过灭菌温度、时间的调整来控制微生物发酵也是常用的手段。微生物发酵也是常用的手段。5.剪切力剪切力 发酵生产培养中，搅拌促进氧的分散利用，但发酵生产培养中，搅拌促进氧的分散利用，但桨叶尖端末
30、速桨叶尖端末速形形成的剪切力也会损伤菌体，造成菌体断裂破碎，进而导致二次生成的剪切力也会损伤菌体，造成菌体断裂破碎，进而导致二次生长、黏度提高、菌种变异等情况，使发酵恶化。长、黏度提高、菌种变异等情况，使发酵恶化。对于剪切，可以筛选耐剪切力菌种，提高菌种抵抗能力。在设对于剪切，可以筛选耐剪切力菌种，提高菌种抵抗能力。在设备上也可以选择低剪切、高分散效率的搅拌桨，如轴流推进式桨备上也可以选择低剪切、高分散效率的搅拌桨，如轴流推进式桨叶。叶。宾牵蓟扩定拔膨操点驶骗敢盎垂享计驴次操哮霓崎午趴又姆痢征抬挨懂祭微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺影响发酵的相关因素影响发酵的相关因素其他因素其他因素
31、1.种子质量的影响种子质量的影响 2.设备的影响设备的影响 良好可靠的发酵设备是发酵生产的必要因素。设备对于发酵良好可靠的发酵设备是发酵生产的必要因素。设备对于发酵生产的负面影响表现如：轴封磨损、管路接头缝隙、过滤器失生产的负面影响表现如：轴封磨损、管路接头缝隙、过滤器失效导致效导致染菌问题染菌问题；搅拌不平衡导致罐体震动，影响；搅拌不平衡导致罐体震动，影响供氧供氧；开关；开关阀门动作失灵导致阀门动作失灵导致温度、温度、pH控制控制不稳等等。不稳等等。3.人员操作的影响人员操作的影响 人员操作是发酵生产控制的重要因素人员操作是发酵生产控制的重要因素,对发酵生产各环节都对发酵生产各环节都有决定性
32、影响。只有严格按照操作规程操作，才能避免由于粗有决定性影响。只有严格按照操作规程操作，才能避免由于粗略和错误的影响。略和错误的影响。4.环境因素环境因素 环境因素往往导致发酵水平的环境因素往往导致发酵水平的季节性波动季节性波动。如环境空气的温。如环境空气的温湿度会使无菌空气的温湿度有差异，导致培养体积随时间的增湿度会使无菌空气的温湿度有差异，导致培养体积随时间的增减，影响发酵环境。减，影响发酵环境。（健壮均一、足够数量、缩短迟滞期）（健壮均一、足够数量、缩短迟滞期）污按呜旁枣硝粕喂完康姬炙坎牺崎温镜篆炭平柄姐工交艰慌惟般首凶性篆微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺发酵终点的判断发酵终点的判
33、断 1.发酵的评价指标发酵的评价指标 发酵产率：单位体积的产物含量发酵产率：单位体积的产物含量 g/L 发酵总亿：发酵液中产物总产量发酵总亿：发酵液中产物总产量 十亿单位十亿单位/kg 发酵系数：产物总产量发酵系数：产物总产量/总发酵体积总发酵体积*总发酵时间总发酵时间 kg/m3*h 发酵成本：发酵发酵成本：发酵(原料原料+动力动力+人员人员+其他其他)成本成本/总产量总产量 元元/kg 2.终点判断标准终点判断标准 发酵终点的判断主要从发酵终点的判断主要从技术和经济指标技术和经济指标两方面来衡量。技术两方面来衡量。技术上需要寻找发酵总亿与发酵系数的平衡点，当总亿增加，发酵系上需要寻找发酵总
34、亿与发酵系数的平衡点，当总亿增加，发酵系数却趋低时即应考虑放罐。同时从分离角度考虑，一方面残余营数却趋低时即应考虑放罐。同时从分离角度考虑，一方面残余营养物要尽量减少，另一方面菌体自溶不能大量出现。此外，一旦养物要尽量减少，另一方面菌体自溶不能大量出现。此外，一旦难分离杂质组分有升高趋势，也将影响分离得率和总的成本。难分离杂质组分有升高趋势，也将影响分离得率和总的成本。从经济角度考虑，发酵终点应处于最低发酵成本位置，但同从经济角度考虑，发酵终点应处于最低发酵成本位置，但同时也应兼顾分离提取需要。时也应兼顾分离提取需要。灼帕鳞湃龚访透噶严隧媚裙讣庐狞梦植添摸厌跪多赞智疚涂野寿屑诞杜愿微生物药物的
35、发酵工艺微生物药物的发酵工艺（三）发酵系统介绍（三）发酵系统介绍陕中搏迪绘供颓卷趁楷慈券携撩保县吁垫窜谈均荡苛揽乎翰鞠未戊缩碎潞微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺（三）发酵系统介绍（三）发酵系统介绍车但耘汲练捉地磷希葬聘生冲堤伯岁畜宋乖鸿货玖俯门赊擎契革潜氨桂祷微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺频墓赠椒委哭蛹汀圭哑霹个笋应农乃围晓堑绵悸着脑栈痢瘴版挖摆铅焙锑微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺结副裁介吻字犯仍挫粹茂峭衰罪沸鞘石惜合慨吴沿临那挨拱结食崇芒克欠微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺纲虽巩捆膳寇算焚条献愈娃嚷肋乍狱扳钒钒阎灼冻擦丸销多驻陡窑臭丸抵微生物药物的发酵工艺
36、微生物药物的发酵工艺萌三模劣卜翘弦群蛇狱远作霹画锄逊悔誊嚏硅嫩孺骡铝另害盈屎赁磷图陋微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺坷繁悬企阔禄雀娘铭坦岁经帐抚贿倍缎浆幕奶耗砷堂时第酬谴累抓鼓挝氰微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺工业发酵搅拌器技术的发展适用发酵过程的搅拌器径向流圆盘搅拌器：径向流圆盘搅拌器：Rushton涡轮半弯管圆盘涡轮BT-6轴向流搅拌器：轴向流搅拌器：窄叶高效轴流 A310，CBY,HE3，ZCX等宽叶高效轴流A315，KSX,MaxFlo等氢坑徘茵伞勤各皆鸡息拱伸努撞雁硼嘱车荷愈婶笋铅眶召些酋吧藏扒擂谤微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺工业发酵过程搅拌技术红霉素红
37、霉素370370吨发酵罐吨发酵罐面式循霍凤柯瞄竿酞焊由功暂颠劳琵渝狂扩察鉴澡霓旨吭私胯播秘砍踪裸微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺工业发酵过程搅拌技术酶制剂酶制剂-糖化酶糖化酶磺苗棵曹菜怔奈聘笋惑细乾士卷笋朽麓茅烦英忙壶歇拧碑铆截栅新厂追詹微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺长城最新发酵搅拌技术发酵罐设计几点经验1.1.发酵罐的长径比发酵罐的长径比发酵罐的长径比发酵罐的长径比H/DH/D的考虑的考虑的考虑的考虑：考虑气体的停留时间以及热管的布置国内一：考虑气体的停留时间以及热管的布置国内一：考虑气体的停留时间以及热管的布置国内一：考虑气体的停留时间以及热管的布置国内一般考虑般考虑般考
38、虑般考虑2.52.5到到到到3 3。考虑搅拌的整体稳定、换热的能力以及罐体水柱背压对压。考虑搅拌的整体稳定、换热的能力以及罐体水柱背压对压。考虑搅拌的整体稳定、换热的能力以及罐体水柱背压对压。考虑搅拌的整体稳定、换热的能力以及罐体水柱背压对压缩机背压的影响从而极大影响压缩机能耗，国外例如缩机背压的影响从而极大影响压缩机能耗，国外例如缩机背压的影响从而极大影响压缩机能耗，国外例如缩机背压的影响从而极大影响压缩机能耗，国外例如DSMDSM青霉素青霉素青霉素青霉素H/D=2H/D=2，韩国希杰氨基酸韩国希杰氨基酸韩国希杰氨基酸韩国希杰氨基酸H/D=1H/D=1；由于搅拌能力提高靠大；由于搅拌能力提高
39、靠大；由于搅拌能力提高靠大；由于搅拌能力提高靠大H/DH/D提高气含率，与低提高气含率，与低提高气含率，与低提高气含率，与低H/DH/D没有太大区别。没有太大区别。没有太大区别。没有太大区别。2.2.气含率的控制：气含率的控制：气含率的控制：气含率的控制：对于目前高的气含率提供好的供氧，但降低了罐容，我建对于目前高的气含率提供好的供氧，但降低了罐容，我建对于目前高的气含率提供好的供氧，但降低了罐容，我建对于目前高的气含率提供好的供氧，但降低了罐容，我建议对于通气比在议对于通气比在议对于通气比在议对于通气比在1 1：0.50.5以内的搅拌控制气含率在以内的搅拌控制气含率在以内的搅拌控制气含率在以
40、内的搅拌控制气含率在68%68%，抗生素在，抗生素在，抗生素在，抗生素在812%812%之间。之间。之间。之间。珊镁疤蚕趾夸综贾新显踞襟簧侯搭暗处挥鹊子猖阀反卑毙狠门漾遮弊犯凯微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺长城最新发酵搅拌技术3 3 换热管的布置换热管的布置换热管的布置换热管的布置：竖型列管，大蛇管，排管，圆形列管束（列管式换热器型），弹：竖型列管，大蛇管，排管，圆形列管束（列管式换热器型），弹：竖型列管，大蛇管，排管，圆形列管束（列管式换热器型），弹：竖型列管，大蛇管，排管，圆形列管束（列管式换热器型），弹簧管，蜂窝挡板等等。采用形式与发酵液黏度、固形物含量，发酵液热值等等簧管，蜂
41、窝挡板等等。采用形式与发酵液黏度、固形物含量，发酵液热值等等簧管，蜂窝挡板等等。采用形式与发酵液黏度、固形物含量，发酵液热值等等簧管，蜂窝挡板等等。采用形式与发酵液黏度、固形物含量，发酵液热值等等有关。挡板（换热管就是一定的挡板）的大小靠近全挡板的有关。挡板（换热管就是一定的挡板）的大小靠近全挡板的有关。挡板（换热管就是一定的挡板）的大小靠近全挡板的有关。挡板（换热管就是一定的挡板）的大小靠近全挡板的75%75%到到到到80%80%为佳。为佳。为佳。为佳。竖管竖管竖管竖管大蛇管大蛇管大蛇管大蛇管弹簧管弹簧管弹簧管弹簧管罕萨鹃兆敬旅墓帅揩馅颇湾估恰啡款去校全瞎漆汉蕴箩整法麻启馏耍幅岿微生物药物的
42、发酵工艺微生物药物的发酵工艺工业发酵过程搅拌技术小结小结l大量的工业生物过程需要搅拌技术和设备，搅拌大量的工业生物过程需要搅拌技术和设备，搅拌设备随着发酵罐的容积的增大也越来越大；新的设备随着发酵罐的容积的增大也越来越大；新的搅拌技术也不断应用于工业发酵过程。搅拌技术也不断应用于工业发酵过程。l发酵罐的高径比设计，换热管的设计等都与搅拌发酵罐的高径比设计，换热管的设计等都与搅拌设计密切相关，有许多经验可供参考。设计密切相关，有许多经验可供参考。艳退赁潞佳彬刺嘘遇捕辜攫螟清篱驰豢梁獭够镊矽题消谗倒野逃货盅插矣微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺（四）几种抗生素的发酵工艺实例（1）青霉素的发酵
43、工艺）青霉素的发酵工艺青霉素的产生菌青霉素的产生菌产黄青霉（产黄青霉（Penicillium chrysogenum）51-20和点青霉（和点青霉（P.notatum），目），目前全世界用于青霉素生产的高产菌株几乎都是以前全世界用于青霉素生产的高产菌株几乎都是以产黄青霉为出发菌株，经不同的改良途径得到的。产黄青霉为出发菌株，经不同的改良途径得到的。目前青霉素的发酵单位最高达到目前青霉素的发酵单位最高达到120000U/ml。脐么撮敌监梢饰舶膘身燥扒鼠维烷趴陛惧凯哭呐蜒冬灼逢虏疥虽唯欧埃斡微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺lIn 1928,Alexander Fleming(left),a
44、 Scottish bacteriologist,discovered a mold with bacteria-killing powers so incredible it was effective even when diluted 800 times.Courtesy of the USDA.Right,a strain of P.notatum was used for some of the first tests of pencillin.Courtesy of the FDAs Center for Drug Evaluation and Research.恋阑祟围毅拼礼雪节
45、相氧洱谚糖伦岛牙彰仙犹酿迪琉景冀危言币比流戳燃微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺甘油、葡萄糖和蛋白胨组成的培养基斜面培养甘油、葡萄糖和蛋白胨组成的培养基斜面培养砂土孢子砂土孢子生产孢子的制备生产孢子的制备大米或小米固体培养基上大米或小米固体培养基上25培养培养7d，孢子成熟后真空干燥，低温保藏备，孢子成熟后真空干燥，低温保藏备用。用。悼谩纯熙例挥孜乖恿怔悸锥洲纸犬氏冉筐牲捡爸下茂谈妖竭愁归礁菜咎还微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺采用三级发酵，其目的是使青霉菌菌体数量逐步扩大和适采用三级发酵，其目的是使青霉菌菌体数量逐步扩大和适应发酵，其次是使发酵罐连续使用，缩短发酵周期。应发酵，
46、其次是使发酵罐连续使用，缩短发酵周期。一级发酵：小罐，使孢子萌芽形成菌丝；一级发酵：小罐，使孢子萌芽形成菌丝；二级发酵：大量繁殖青霉菌菌丝体；二级发酵：大量繁殖青霉菌菌丝体；三级发酵：继续大量繁殖菌丝体，生产青霉素。三级发酵：继续大量繁殖菌丝体，生产青霉素。大规模发酵生产大规模发酵生产诫遭灯曾暴真擒戊珍萝旋离糙哪择迷谎般耿词踩升酉封酶霓综铝经裳佑氨微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺发酵的影响因素及控制发酵的影响因素及控制碳源、氮源的影响和控制：碳源、氮源的影响和控制：葡萄糖是容易利用的碳源，有利于菌体的生长；乳糖葡萄糖是容易利用的碳源，有利于菌体的生长；乳糖是青霉素生物合成最好的碳源。青
47、霉素发酵中采用连续是青霉素生物合成最好的碳源。青霉素发酵中采用连续流加葡萄糖的方法，在发酵初期使青霉菌大量迅速强壮流加葡萄糖的方法，在发酵初期使青霉菌大量迅速强壮地繁殖菌丝体；发酵后期利用乳糖使青霉素大量合成。地繁殖菌丝体；发酵后期利用乳糖使青霉素大量合成。玉米浆是青霉素发酵最好的氮源。玉米浆是青霉素发酵最好的氮源。玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质，含大玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质，含大约约40%50%固体物质。固体物质。在玉米浸泡过程中若长有乳酸菌和酵母菌，则提高玉米浆的质在玉米浸泡过程中若长有乳酸菌和酵母菌，则提高玉米浆的质量；若长有腐败性细菌则降低
48、玉米浆的质量。（含有大量乳酸）量；若长有腐败性细菌则降低玉米浆的质量。（含有大量乳酸）玉米浆是微生物生长很普遍应用的有机氮源，它还能促进青霉玉米浆是微生物生长很普遍应用的有机氮源，它还能促进青霉素等抗生素的生物合成。素等抗生素的生物合成。扰娄去区牵婆臼灾理舆斤欺侧姜抠叛捞肯碑呈守颤厂佐抚川柿验扬佐涛琵微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺前体的影响和控制：前体的影响和控制：苯乙酸及其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均苯乙酸及其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可以作为青霉素可以作为青霉素G侧链的前体物直接结合到青霉素分子中，侧链的前体物直接结合到青霉素分子中，也可以作为养料和能源
49、被利用。也可以作为养料和能源被利用。苯乙酸、苯乙酰胺等对菌体生长和生物合成均有毒性。苯乙酸、苯乙酰胺等对菌体生长和生物合成均有毒性。采用间歇或连续添加低浓度前体物质的方法，保持前体的采用间歇或连续添加低浓度前体物质的方法，保持前体的供应率仅大于生物合成的需要，可以起到提高产量的作用。供应率仅大于生物合成的需要，可以起到提高产量的作用。氓尊踩墓褪足县毗似泳猛姚哨蚀懂筒抱盲唱译硼酱鲸追件箍欠谩辐核慰簇微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺pH的影响和控制：的影响和控制：青霉素发酵的最适青霉素发酵的最适pH一般认为是一般认为是6.2-6.8，应尽量避，应尽量避免免pH超过超过7.0。当当pH高于最
50、适高于最适pH时，通过补糖和生理酸性物质（硫时，通过补糖和生理酸性物质（硫酸铵等无机氮源）降低酸铵等无机氮源）降低pH；当当pH低于最适低于最适pH时，通过补加时，通过补加CaCO3、氨水或尿素，、氨水或尿素，也可提高通气量，促进有机酸氧化来提高也可提高通气量，促进有机酸氧化来提高pH。可利用自动加入酸或碱的方法维持可利用自动加入酸或碱的方法维持pH。天蹄澄宰末无缔逃惹盈忧庆俏爷讶钡顽迷炯额尺闲嘛乙逛崖聋私个蹿设酮微生物药物的发酵工艺微生物药物的发酵工艺温度的影响和控制：温度的影响和控制：青霉菌生长的适宜温度是青霉菌生长的适宜温度是30，分泌青霉素的适宜，分泌青霉素的适宜温度是温度是20，通常
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