《医学真菌常用培养基的制备和应用.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《医学真菌常用培养基的制备和应用.doc（25页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、医学真菌常用培养基的制备和应用?296?中国真菌学杂志2010年1O月第5卷第5期ChinJMvcol,October2010,Vol5,No.5医学真菌常用培养基的制备和应用朱红梅徐红温海(上海长征医院全军真菌病重点实验室)【关键词】医学真菌;培养基;制备【中图分类号】R446.53【文献标识码】B【文章编号】16733827(2010)05-029611真菌的培养方法和细菌培养方法基本相同,但真菌除试管及平皿培养外,还有小培养(玻片培养)直接观察真菌形态结构.真菌对环境抵抗力强,因此所需营养与细菌有所不同,pH范围较大,真菌菌落较大,杂菌污染时易于发现,除少数菌种外一般培养并不困难.1真菌
2、的基础培养基1.1沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)配方葡萄糖40g,蛋白胨10g,琼脂1820g,水1000mL.将以上成分倒入烧杯或铝锅内,先加少量蒸馏水进行加热溶解,不断搅拌,待完全溶解后补足蒸馏水分至所需要的总体积,并加入氯霉素50100Izg/mL分装试管,115oC10min高压灭菌.用途用于真菌常规培养.1.2沙氏液体培养基配方葡萄糖40g,蛋白胨10g,水1000mL.混合以上成分,分装试管中,11510min高压灭菌.用途观察真菌在液体培养基中生长状态.念珠菌属在此基中生长良好.1.3改良沙氏琼脂基配方麦芽糖20g,蛋白胨10g,琼脂20g,水1000mL.制法同SDA.为防止细
3、菌生长,培养基中可加庆大霉素4050g/mL,或加氯霉素50g/mL,抑制污染真菌可加入放线菌酮500Ixg/mL,但影响新生隐球菌和曲霉菌生长.加入维生素B0.1mg/mL,可以促进紫色癣菌和断发癣菌生长繁殖.;杠作者简介:朱红梅,女(汉族):博士,副主任医师.E-mail:通讯作者:温海,E.mail:?继续教育?加入酵母浸膏5mg/mL,可促进皮肤癣菌生长.1.4保存菌种培养基配方蛋白胨10g,琼脂20g,水1000mL.制法:同SDA.用途保存菌种.2浅部真菌常用的鉴定培养基2.1米饭培养基主要配方大米8g,蒸馏水或自来水25mL,置于125mL的烧瓶中.也可根据1g米,3mL水的比例
4、,使用平皿,试管等容器.高压灭菌,121qC6.8kg15rain,冷却后备用.用途用于鉴别非典型的羊毛状小孢子菌和奥杜盎小孢子菌,还能促进许多皮肤癣菌产生孢子,有助于鉴定.2.2玉米粉吐温琼脂配方玉米粉50g,葡萄糖2g,琼脂15g,吐温.8010mL加蒸馏水1000mL,将玉米粉倒人1000mL蒸馏水中,混合均匀.高压121oC6.8kg10min.用2层纱布过滤后,蒸馏水补足1000mL.加入琼脂,葡萄糖,吐温.80后加热至沸.高压灭菌后分装试管置斜面,冷却后冰箱保存.试管斜面有效期为30d,平皿14d.用途典型的红色毛癣菌在沙氏琼脂培养基上有深红色的色素,但许多菌株在初代培养的沙氏琼脂
5、培养基上却不产生这种色素.含0.2%葡萄糖玉米粉吐温琼脂的培养基能促进红色毛癣菌产生深红色色素,而其他常见的皮肤癣菌则无这种现象,所以可用于红色毛癣菌的鉴别.玉米粉吐温琼脂如不加葡萄糖可用作念珠菌鉴定的小培养,以促进白念珠菌假菌丝和厚壁孢子的形成,也会促进暗色孢科真菌孢子的形成.2.3尿素琼脂P国真菌学杂志2010年1O月第5卷第5期ChinJlIvcol,October2010,Vol5,No.5配方葡萄糖10.0g,琼脂20.0g,蛋白胨1.0g,NaC15.0g,KH2PO42.0g,酚红0.012或0.02%水溶液6mL,蒸馏水l000mL,20%尿素液(后加).各成分混合均匀后调pH
6、至6.8.加入琼脂20g,煮沸至琼脂完全溶解.置高压消毒,4.54kg(10磅)10min.取出后冷却至4550C时,每450mL培养基中加入抽滤灭菌的20%尿素溶液50mL,混合均匀后分装斜面,冷后备用.用途新生隐球菌等一些隐球菌和一些酵母能够尿素酶,而许多其他酵母包括念珠菌属中的一些种却不能产生尿素酶,这个特性构成酵母鉴定,鉴别的依据之一.尿素酶能分解培养基中的尿素,并形成大量的氨,使培养基pH值升高而呈碱性,酚红指示剂因而变红.另外皮肤癣菌的尿素酶试验也用此培养基,但葡萄糖的浓度不是1%而是5%.用于鉴别红色毛癣菌和须癣毛癣菌,后者能在7d内使培养基变红.2.4皮肤癣菌鉴别琼脂(DTM)
7、配方葡萄糖10g,蛋白胨10g,琼脂20g,酚红(0.2%)6mL,盐酸(0.8N)蒸馏水1000mL.制法待琼脂加热溶化后,再加入其他成分混匀,121oC15min高压灭菌,冷至45cI=加酚红与盐酸氯霉素或庆大霉素.用途鉴定皮肤癣菌.2.5橄榄油培养基配方马玲薯200g,葡萄糖15g,蛋白胨10g,酵母浸膏10g,橄榄油20mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL.制法:先将马玲薯制成浸汁,然后加人其他成分,加热溶解,分装于试管中,121oC20min高压灭菌,取出置成斜面,室温保存.3深部真菌常用的鉴定培养基3.1叻酸琼脂配方葡萄糖59.0g,(NH)s0酵母浸膏29.0g,K2HPO40.
8、89g,MgSO4?7H200.79g,咖啡酸0.189g,枸橼酸铁溶液4mL,琼脂20.09g,蒸馏水加至1000mL.充分混合,加热至琼脂溶解,高压灭菌后置斜面,冷却后备用.用途咖啡酸试验用于鉴别新生隐球菌.将待鉴定酵母接种于咖啡酸琼脂斜面,置25培养2472h,观察有无色素产生.新生隐球菌会产生棕色色素,其他隐球菌可能有很淡的色素,而酵母菌则不产生色素.?297?3.2马铃薯(PDA)培养基配方马铃薯200g,琼脂20.0g,葡萄糖20.0g,蒸馏水1000mL.将马铃薯洗皮,切成碎块,加入煮沸20min.纱布过滤.滤液中加入葡萄糖和琼脂,加热使之溶化.再补足水量至1000mL,分装,高
9、压灭菌.用途用于培养和鉴定曲霉菌和青霉菌.3.3米粉吐温琼脂培养基配方米粉10.0g,琼脂20.0g,吐温一8O10.0g,蒸馏水1000mL.先将米粉用半量蒸馏水调成糊状,用另外半量水将琼脂溶化,混合两部分,加入吐温一80,搅匀,补足水量,校正PH值,分装,l5磅灭菌20min.用途用于培养白念珠菌产生厚壁孢子和菌丝.3.4察氏琼脂培养基配方硝酸钠3g,磷酸氢二钾1g,硫酸镁0,5g,氯化钾0.5g,硫酸铁0.O1g,蔗糖30g,琼脂20g,水1000mL.除了蔗糖及琼脂外,其余成分均加入水中.在水浴中加热约15min后,稍冷却即将蔗糖及琼脂加入.121oC20min高压灭菌.用途用于分离,
10、培养及鉴定真菌及放线菌常用的培养基,对耐高渗透压的菌株,可增加蔗糖含量至30%40%,为高渗察贝克氏琼脂.用0.5%蛋白胨代替硝酸钠,即为察贝克蛋白胨琼脂,适用培养酵母菌.3.5芽管实验培养基成分人血或动物血清(或鸡蛋清).制法将以上血清装入12mm75mm试管,每0.3mL,用棉塞塞好放-70C冰箱备用,保存期1a.用途鉴定白念珠菌.接种后放37C温箱孵育2.5h,白念珠菌可长出芽管,而热带及其他念珠菌则无.3.6奴卡菌鉴定培养基配方1液:牛肉浸膏3g,蛋白胨5g,琼脂l5g,蒸馏水1000mL.2液:酪氨酸5g,黄嘌呤4g,先将琼脂加入90%水量,加热溶化,再加入牛肉浸膏和蛋白胨熔化,调整
11、至pH7.0,分装于三角烧瓶中,121clC20min高压灭菌,待用.(2)将酪氨酸溶于少量蒸馏水中,11320min高压灭菌,待用.使用时混合(1),(2)两液,摇匀,在无菌操作下分装于试管内,制成斜面或平皿基,备用.?298?中国真菌学杂志2010年1O月第5卷第5期ChinJMycol,October2010,Vol5,No.5用途鉴定奴卡菌与链霉菌.3.7高斯氏合成培养基硝酸钾1g,氯化钠0.5g,磷酸氢二钾0.5g,硫酸镁0.5g,硫酸亚铁0.01g,可溶性淀粉20g,琼脂20g,蒸馏水1000mL,将可溶性淀粉用少量蒸馏水调成糊状,加入约半量水煮沸,加入其他成分,另将琼脂加半量蒸馏
12、水熔化,再与前者混合,并补足水量,调整至pH7.27.4,分装试管中,121oC20rain高压灭菌.用途培养和鉴定放线菌.3.8葡萄糖酵母汁蛋白胨液体基成分蛋白胨10g,琼脂5g,蒸馏水1000mL,葡萄糖20g,混合以上成分加热煮沸,分装于试管中,113灭菌15rain.用途分离培养酵母菌.3.9子囊琼脂成分氯化钠5g,琼脂10g,蒸馏水1000mL,葡萄糖2.5g,牛肉浸膏10g,混合以上成分,115灭菌10min.用途培养酵母菌子囊.3.10石膏块培养基取硫酸钙(CaSO?1/2H20)8份,水3份,混合制成楔状石膏块斜面,置于管底垫棉花的试管内,用稀麦芽汁(糖度为1.5波林),或2%
13、甘露醇和0.5%磷酸氢二钾溶液湿润之,113clC灭菌3Orain.用途培养酵母菌产生子囊孢子.3.11脱脂牛奶培养基制法取新鲜牛奶100mL,离心(3000r/20min),去除表面奶皮,即成脱脂牛奶,分装于试管中,常压间歇灭菌3次,每次30min.根据需要可加石蕊作指示剂,以使结果显示清晰.石蕊用量为100mL牛奶,加2.5%石蕊水溶液0.4mL.用途鉴别放线菌,酵母菌等对牛奶的利用能力.3.12毛霉合成培养基成分葡萄糖40g,天冬酰胺2g,磷酸二氢钾0.5g,硫酸镁0.25g,硫胺素0.005g,琼脂l5g,水1000mL.pH6.97.1.制法除硫胺素外,其余成分加于水中,混匀,加热溶
14、解,调pH,分装,11620min高压灭菌.硫胺素配制水溶液,过滤除菌,用时按比例无菌加入.用途培养与鉴别毛霉.3.13同化氮源琼脂成分葡萄糖20g,磷酸二氢钾Ig,硫酸镁(MgSO4?7H2o)0.5g,酵母浸膏0.2g,琼脂20g,水1000mL,pH6.46.6.制法各成分相加,混匀,加热溶解,调pH,1l620min高压灭菌,用于测氮源的化合物,常为硫酸铵,硝酸钾等,加入量可用0.5%1%.用途=910定酵母利用氮源的能力,可用生长图谱法试验.3.14糖发酵肉汤基础成分牛肉浸膏3g,蛋白胨5g,氯化钠5g,1.6%溴甲酚紫1mL,水1000mL,pH7.2.制法各成分相加(溴甲酚紫除外
15、),混匀,加热溶解,调至pH7.2,加入溴甲酚紫,116oC20min高压灭菌.使用前,加入糖溶液10%溶液,煮沸15min杀菌,用110cIC10min高压灭菌更佳,浓度为培养基的2%.肉汤基础加入0.5%琼脂,即为糖发酵半固体培养基.用途酵母发酵糖类的能力测定.4特殊培养基4.1富集培养基脑心浸双相培养基(BiphasicMediumofBrainheartInfusion,RobertsandWasgington,1975)从血液标本中分离真菌,或从正常无菌的骨髓,脊髓等标本中分离难培养真菌.脑心葡萄糖血琼脂(BrainHeartGlucoseBloodAgar)分离培养深部病原性真菌,
16、若使用5%10%CO培养箱,可培养厌氧放线菌.淀粉琼脂(StarchAgar)培养丝状真菌.酵母浸膏琼脂I(YeastExtractAgarI)培养真菌,可刺激毛癣菌属产生大分生孢子.特别注意酵母浸膏加量,过多会刺激菌丝生成,不利孢子产生.酵母浸膏琼脂(YeastExtractAgarII)培养毛壳菌极其他子囊菌.毛癣菌琼脂17号(TrichphytonAgarNumber1.7,Difco,1953)用于鉴别各种毛癣菌.由于各种毛癣菌毛癣菌有不同的营养要求,用系列培养观察它们的生长情况,判断其所属.4.2选择性培养基溴甲酚绿琼脂培养基(BromcresolGreenAgarMedium,Ha
17、roldandSnyder,1969)多种念珠菌及中国真菌学杂志2010年10月第5卷第5期ChinJMycol,October2010,ol5,No.5其他酵母菌在此培养基生产特殊颜色的菌落,有利于挑取单个菌落作纯培养,并可对其中的一些做初步鉴别.加入新霉素可减少细菌的污染.皮肤癣菌鉴别琼脂(DermatophytesIdentityAgar,DTM)分离,培养及鉴别皮肤癣菌,多数皮肤癣菌在生长过程中可使分解的氨基酸产碱,培养基由黄色变为红色,污染真菌一般不变色,白念珠菌等酵母也不变色.油菊籽培养基(NigerSeedAgar,StaibAgar,BirdseedAgar,GuizotiaA
18、byssinicaCreatinineAgar,DolanandRoberts,1974)为选择鉴别培养基,可从隐球菌属及其他酵母菌中,将新生隐球菌区别出.皮癣菌试验培养基(DermatophyteTestMedi.Hm,Taplin,Zaias,Rebell,1969)为一种选择性培养基,放线菌酮可抑制多种常见霉菌,庆大霉素和四环素可抑制大多数的细菌污染.酚红可检出皮癣菌及有关真菌的产碱能力,故为一种鉴别试验.有些非皮癣菌也可产生阳性(红色)颜色反应.熊果甙琼脂(或称杨梅苷琼脂,ArbutinAgar)检查酵母菌分解熊果甙的能力.若能分解,菌苔表面可呈现褐色.真菌选择性培养基(Funguss
19、electionAgarwithCycloheximideandChloramphwnicol,MycoselAgar,MycobioticAgar,difco,1960)可从被大量霉菌或细菌菌群污染的标本中分离病原性真菌.咖啡酸琼脂培养基(CaffeicAcidAgarmediUlll,Healey,DillavouandTaylor,1978)鉴别新生隐球菌.新生隐球菌在此培养基上室温培养可形成可褐色菌落,而其他的隐球菌,念珠菌,球拟酵母等均不产生颜色.酵母浸粉磷酸盐培养基(YeastExtractPhosphateMedium,Smithandgoodman,l974)从污染标本中分离组
20、织胞浆菌及皮炎芽生菌.但需加氨水.4.3培养特性研究用培养基同化碳源琼脂基础I(CarbonSourcesAsimila.tionAgarBaseI)分固体及液体两种.固体培养基适用于生长图谱法,观察酵母菌同化碳源的能力.液体培养适用于检查生长缓慢的酵母菌利用碳源的能力.产酯培养基(EsterformationMedium)酵母形成酯试验.?299?同化乙醇培养基(EthylAlcoholAssimilationMedium)酵母同化乙醇试验.糖发酵肉汤基础(SugarFermentationBrothBase)酵母发酵糖类的能力测定.低温试验用琼脂或冰冻琼脂(LowtemperatureTe
21、stAgar;FreezeAgar)皮肤癣菌接种后,置2IOC冰箱中,可促使铁锈色小孢子菌产生大分生孢子.明胶培养基(GelatinMedium)用于观察真菌,放线菌等对动物蛋白(明胶)液化利用的能力.油脂分解培养基(GreaseDecompositionMedium)为检查酵母脂肪分解试验的基础培养基.克来因氏琼脂(KleynAgar,即醋酸钠培养基)培养酵母形成子囊孢子.钼培养基(MolybdenumMedium)分离鉴别酵母,特别是白念珠菌.白念珠菌为中等大光滑型橄榄色菌落;星形念珠菌为有光泽的浅灰色菌落;热带念珠菌为光滑,深蓝色或深灰色菌落;克柔氏念珠菌为光滑,暗自色菌落;酿酒酵母菌为
22、光滑有光泽的浅蓝色或深蓝色菌落.毛霉合成培养基(MucorSyntheticMedium)培养鉴别毛霉.同化氮源琼脂基础(NitrogenSourceAssimilationAgarBase)鉴定酵母利用氮源的能力,可用生长图谱法试验.米粉吐温.80琼脂(RiceflourTween一80Agar)培养的念珠菌产生厚壁孢子及菌丝.米饭培养基(Ricemedium)可促使犬,歪斜及奥杜盎等小孢子菌产生大分生孢子,也能刺激某些皮肤癣菌产生孢子.脱脂牛乳培养基(SkimMilkMedium)用于鉴定念珠菌属和丝孢酵母属.淀粉样化合物测试培养基(StarchLikeSubstancesAssaymed
23、ium)测定酵母菌产生淀粉样化合物的能力.经2528C培养12周,若形成淀粉样化合物,滴加碘液后,在菌体周围可形成蓝色.尿素琼脂(UreaAgar)鉴定红色癣菌和须癣毛癣菌,后者生长34d后,可使培养基由黄色变为红色,即为阳性反应.念珠菌及酵母为阴性反应,培养基不变色.4.4染色检查HE染色HE染色对许多真菌都适用,而且不掩盖真菌本身的颜色,并能显示组织反应和中国真菌学杂志2010年10月第5卷第5期ChinJMycol,October2010,Vol5,No.5SplendoreHoeppli现象,是真菌组织病理检查必不可少的染色方法,尤其对曲霉和接合菌(毛霉,根霉)等染色较好.但大多数病原
24、真菌经HE染色后,真菌的颜色和组织的颜色接近,虽能辨别轮廓,但不易区别.尤其是当组织中真菌成分很少的时候,更易忽略.为了解清楚地显示组织中的真菌,除HE染色外,还应根据需要采用其他染色方法.革兰染色(gramstain)革兰染色有Brown法,Brenn法,BrownHopps法,MacCallumGoodpas.ture法等.真菌和放线菌类为革兰染色阳性,呈蓝黑色,核呈红色.其他革兰阴性微生物呈红色,背景为黄色.革兰染色法对放线菌,奴卡菌和链霉菌染色较好,而且可以发现组织中真菌与细菌的双重感染.缺点是对许多真菌无选择性的染色作用.抗酸染色(Acidfaststain)抗酸染色阳性呈红色.部分
25、抗酸染色阳性呈节段性红色,背景为蓝色.抗酸染色适用于星形奴卡菌,巴西奴卡菌,豚鼠奴卡菌等,也适用于结核分枝杆菌和其他分枝杆菌.有时奴卡菌在组织中抗酸染色也呈阴性,真菌则抗酸染色全部阴性.GF染色(Gridleyfungusstain)孢子染成深玫瑰色至紫色,菌丝为深蓝色或深玫瑰色,弹力纤维和黏蛋白等呈深蓝色,背景黄色.嗜银染色(gomorimethenaminesilverstain,GMS)真菌细胞壁,放线菌,奴卡菌,链霉菌,网状纤维,弹力纤维等染成黑色,黏蛋白呈深灰色,菌丝内胞浆呈深玫瑰色,背景为淡绿色.GMS染色时要经常检查以保证染色的时间适当,以免染色过深.若染色过深,红细胞和裸露的核
26、会染黑而与酵母混淆;血管会着色与接合菌的菌丝相似.对肺囊虫病感染尤为重要,因为肺泡中的红细胞也可为新月形,染黑后极似肺囊虫孢子.过碘酸锡夫染色(PeriodicacidSchiffstain.PAS)因为真菌和组织中含有的多糖成分如糖原,黏蛋白,透明质酸,血栓纤维蛋白,类淀粉物及胶质颗粒等,经其染色都呈红色,核蓝色,背景为淡绿色.PAS染色对放线菌,奴卡菌和链霉菌不能显色或染色很差,所以这些菌的感染不应用PAS染色检查.另外,因黏蛋白也着色成红色,所以PAS染色法不适用于未经消化处理的呼吸道分泌物.GF,GMS和PAS这3种特殊染色方法都非常适用于真菌,其中GMS染色优于GF和PAS染色,尤其
27、是对老的和无活力的真菌更加适用.GMS染色对放线菌,奴卡菌和链霉菌也同样适用.当标本中真菌数量极少时,更应采用GMS染色法,因为染色后的真菌与背景对比强烈,非常明显,不易忽略.GMS染色法的缺点是会掩盖真菌本来的颜色和周围组织的反应,而且GMS染色可能着色过深而不能分辨真菌结构的细节.若与HE染色法联合使用,即先用GMS染色,然后用HE染色法复染,就结合了这两种染色法的优点,既易发现真菌,又能显示组织反应,也对放线菌类适用.当只有1张病理组织片时,GMSHE染色法应为首选,但这种方法的缺点也会掩盖真菌的本色.吉姆萨染色(Giemsastain)吉姆萨染色将真菌染成浅到深蓝色,核蓝色,荚膜蓝灰色
28、至红色,背景为粉红色或淡蓝色.吉姆萨染色用于荚膜组织胞浆菌细胞内孢子的辨认.孢子周围有晕,系染色过程中细胞壁皱缩所致而非荚膜.黏蛋白卡红染色(Mayermucicarminestain,MMS)黏蛋白卡红染色用于新生隐球菌的染色,能将新生隐球菌和与其形态,大小相似的酵母鉴别开来.MMS染色将新生隐球菌的荚膜染成红色至深玫瑰色,核呈黑色,背景黄色.但这种染色并非特异,鼻孢子菌,一些皮炎芽生菌的孢子也会被染成红色,但它们的形态不同,容易区别.其他染色1)子囊孢子染色(ascosporestain):能将酵母菌染成红色,子囊孢子呈绿色,对比鲜明.2)Wright染色:适用于血涂片,能将单核细胞核其他
29、血细胞内的荚膜组织胞浆菌染成蓝至深蓝色.4.5生化检查和营养为了鉴定菌种,有时必须依赖一些生理,生化实验和营养试验.5酵母鉴定试验培养基5.1碳源同化试验酵母能发酵某种糖就一定能同化该糖,故同化试验只需做不能被发酵的碳源,一般用生长图谱法.碳源有葡萄糖,半乳糖,山梨醇,蔗糖,麦芽糖,纤维二糖,海藻糖,乳糖,蜜二糖,棉子糖,松三糖,菊芋糖,可溶性淀粉,D.木糖,C.阿拉伯糖,D一阿拉伯糖,D.核糖,L一鼠李糖,乙醇,甘油,赤癣糖醇,核糖醇,矛醇,D一山梨醇,水杨苷,-甲基-D.葡萄糖苷,杨梅苷,DL一乳酸,瑚珀酸,柠檬酸,肌醇等.方法使用半固体碳源同化培养基.取20中国真菌学杂志2010年10月
30、第5卷第5期ChinJMvcol,October2010,Vol5,No.5mL装人大试管,3.632kg(8磅)30min灭菌.另将二接种环生长3d的待鉴定酵母加1mL无菌蒸馏水,要匀成混悬液,倒人已冷却至4550的大试管中,与碳源同化培养基混合均匀,再倒入无菌平皿中,待其凝固.然后倒置于28温箱中数小时,使表面干燥.底部标上碳源名称.培养基用无菌小铲开沟,沟不能开至中心点,以免培养基移动.每个平皿最多可分隔成6块,可同时测试6种碳源.每块培养基表面用无菌不锈钢匙或牙签按底部标记加入待测碳源.加不同的碳源需用不同的小匙,以免碳源相互污染.也可用圆纸片浸10%待测碳源(应煮沸消毒),置每块培养
31、基表面.以葡萄糖为对照,置25cI=培养12d,观察结果.碳源四周若有酵母生长圈表示阳性,即该菌能同化这种碳源.凡生长缓慢的酵母可用液体碳源同化培养基,将待测碳源和待鉴定酵母加入培养基,25培养12周,观察有无菌落生长.必要时可延长至3周,仍以葡萄糖为对照.若培养基混浊,有菌璞,菌环和菌岛等形成表示同化试验阳性,即待鉴定酵母能同化这种碳源.培养基碳源同化固体培养基:(NH)SO5.0g,酵母浸膏0.2g,KH2PO41.0g,MgSO4?7H200.5g.琼脂20.0g,蒸馏水l000mL.将琼脂与蒸馏水混合加热至沸,待琼脂溶化后加入上述其他成分,搅拌均匀装三角烧瓶,塞上棉花塞,3.632kg
32、(8磅)灭菌30min后倒入平皿,每平皿20mL.待冷却凝固后底朝上置2830的温箱中数小时,使表面干燥,即可使用.碳源同化液体培养基:(NH4)2SO45.0g,MgSO47H200.5g,NaC10.1g,KH2PO41.0g,CaC12?2H200.1g,酵母浸膏0.2g,蒸馏水1000mL,全部成分混合搅拌均匀后,分装试管,每管3mL.3.632kg(8磅)灭菌20min,冷却后即可使用.试验时以葡萄糖为对照.适用于鉴定生长缓慢的酵母.碳源浓度为0.5%.5.2碳源发酵试验碳源发酵试验所用的糖类有葡萄糖,半乳糖,蔗糖,麦芽糖,乳糖,棉子精,蜜二糖,纤维二糖,海藻糖,松三糖,菊芋糖,可溶
33、性淀粉,.仅.甲基一D一葡萄糖苷等.容器一般采用杜氏管,菌丝多的酵母采用艾氏管.培养基使用12.5%豆芽只汁或0.6%酵母粉浸汁,糖浓度为2%,棉子糖为4%.试验时若杜氏管内小管顶部或艾氏管封闭一端的顶部有二氧化碳气体产生为阳性,说明待鉴定酵母能发酵这种糖.凡能发酵葡萄糖的酵母,就能发酵果糖和甘露搪,所以测定葡萄糖后,不必再测定果糖和甘露糖.方法取二接种环已生长3d的待鉴定酵母,置2mL蒸馏水中摇匀成混悬液,再取0.2mL混悬液滴人发酵管中.发酵管内含3mL液体培养基和用于发酵的糖.另取1管不加糖的作为对照,以观察待鉴定菌种是否携带糖.接种完毕后置25qC,每天观察结果,检查有否二氧化碳气泡产
34、生,并轻轻摇动培养基.艾氏管每次观察结束后还必须用接种针将菌丝尽量推入试管封闭端以免影响观察.一般观察23d即可.如无发酵可延长至10d,半乳糖发酵较慢,宜观察2周1个月.每次检查时应先观察对照管有无生长,若有生长,说明该酵母本身携带糖类,全部实验应重做.培养基12.5%豆芽汁:黄豆芽125g加水1000mL,煮沸30min,过滤后加蒸馏水补至l000mL,3.632kg(8磅)30min高压灭菌后分装.0.6%94酵母粉浸汁:60g干酵母粉加水至1000mL,6.81kg(15磅)15min高压灭菌,趁热用双层滤纸过滤,再3.632kg(8磅)30min高压灭菌后分装.5.3产子囊孢子试验用
35、途子囊菌亚门的酵母.尤其是酵母属(Saccharomyces)中的一些种,在产子囊孢子琼脂上能产生子囊孢子,为菌种鉴定的重要依据.方法将待鉴定菌种划线接种于产子囊孢子琼脂上,同时接种1管酿酒酵母(S.serevisiae)作为对照,置室温培养3d.各挑取菌落,以蒸馏水制成涂片,吹干后热固定,抗酸染色后置显微镜下检查.子囊孢子呈红色.着检查阴性,需继续培养,每周检查1次,连续3周.若此时对照阳性而待鉴定菌种仍无子囊孢子出现,结果判为阴性.也可采用子囊孢子染色法,于囊孢子染成蓝绿色而其他细胞呈红色,更清楚易辨.产子囊孢子琼脂(ascosporwagar)培养基醋酸钾10.0g,酵母浸膏2.5g,葡
36、萄糖1.0g,琼脂30.0g,蒸馏水1000mL.将各成分充分混合后加热至沸,使琼脂溶解.高压灭菌后分装平皿.5.4放线菌酮耐受试验用途念珠菌属的一些种对放线菌酮敏感,利用这一特性可有助于鉴别念珠菌属中的一些种及?302?中国真菌学杂志2010年1O月第5卷第5期ChinJMycol,October2010,Vol5,No.5其他的一些病原真菌.方法挑取待鉴定念珠菌加无菌蒸馏水制成混悬液,划线接种于含有放线菌酮的沙氏琼脂培养基上,接种量为一接种环.另接种1管不含放线菌酮的沙氏琼脂培养基为对照.置室温培养3d,观察结果.放线菌酮耐受试验用于其他真菌的鉴定时,方法同上,但应观察4周时问.结果判定两
37、管均有生长判为阳性,表示对放线菌酮不敏感,能耐受.有放线菌酮的斜面无生长或比对照管生长差,判为阴性,表示对放线菌酮敏感.在含放线菌酮的沙氏琼脂培养基上能够生长的念珠菌为白念珠菌(99%),伪热带念珠苗,季也蒙念球菌,类星形念珠菌,不能生长的念珠菌为近平滑念珠菌,热带念珠菌和克柔念珠菌.5.5芽管试验方法用无菌细吸管吸取少量待鉴定酵母接种于0.5mL无菌的兔,牛或人血清中,混合均匀.将血清连吸管一起置37培养,2h后吸取血清标本作涂片,镜下观察有无芽营形成.芽管为短菌丝,与母细胞连接处无缩窄环,判为阳性.芽孢和假菌丝则有缩窄.如有疑问可用油镜复查.另取1管血清接种白念珠菌作为对照.培养时间不得&
38、gt;3h.若>3h,热带念珠菌或其他一些真菌也有可能形成芽管,产生假阳性结果.结果判断白念珠菌和类星形念珠菌芽管试验阳性,其中98%为白念球菌,所以芽管试验阳性一般可报告为白念珠菌.由于菌株之间存在差异,有些白念珠菌也会不形成芽管.5.6米粉小培养用途与玉米粉吐温琼脂培养和芽营试验的意义相同,用于观察酵母的形态以利于鉴定白念珠菌,念珠菌属,丝抱酵母属和地霉届.方法按配方称取当年新糯米所磨的米粉,加水搅拌均匀,隔水煮30min.如颗粒太粗,可用细纱布过滤.滤液中加入琼脂,加热至溶化,再加入吐温一80,蒸馏水补足1000mL,分装试管后高压灭菌.冷却后置冰箱保存.用时取出,将试管先在火焰上
39、慢慢加热,待培养基融化,倒在玻片上用作小培养.在小培养上(平板)划线接种待鉴定菌种,以白念珠菌作为对照.每块平板可接种6个菌株,盖上无菌盖玻片,置无菌平皿中,加湿棉球保湿,25培养48h.将平板置显微镜下检查,观某其形态.有假菌丝和芽孢为念珠菌属,有顶端厚壁孢子形成则98%为白念珠菌,2%为类星形念珠菌,有假菌丝,芽孢和关节孢子为丝孢酵母,仅有假菌丝和关节孢子为地霉属,无菌丝只有孢子为酵母.米粉培养基米粉10.0g,吐温一80mL,琼脂10.020.0g,蒸馏水1000mL.5.7硝酸盐同化试验方法采用生长图谱法.取2接种环已生长2448h的待鉴定酵母,置1mL无菌蒸馏水中成混悬液,倒人已冷却
40、至4550cc含15mL无氮源培养基的大试管中,混合均匀后倒平皿,待凝固.用记号笔在平皿反面将平皿一划为二.用无菌不锈钢匙或牙签加少量硝酸钾于半边培养基的表面,另半边加少量蛋白胨.用白隐球菌(Cryptococcusalbidus)和新生隐球菌作为阳性和阴性对照.5.8咖啡酸试验方法咖啡酸试验用于鉴别新生隐球菌.将待鉴定酵母接种于咖啡酸琼脂斜面,另接种1管白念珠菌为阴性对照,1管新生隐球菌为阳性对照.置25培养2472h,观察有无色素产生.新生隐球菌会产生深棕色色素,其他隐球菌可能有很淡的色素,而酵母菌则不产生色素.培养基咖啡酸琼脂(eaffeicacidagar):葡萄糖59.0g,(NH4
41、)s059.0g,酵母浸膏29.0g,K2HPO40.89g,MgSO4?7H2O0.79g,咖啡酸0.189g,枸橼酸铁溶液4mL,琼脂20.09g,蒸馏水加至1000mL.充分混合.加热至琼脂溶解,高压灭菌后置斜面,冷却后备用.咖啡酸米粉琼脂(caffeicacidricePowderagar):米粉10.0g,琼脂20.0g,吐温一8O10mL,咖啡酸0.3g,蒸馏水1000mL.将米粉,琼脂煮溶后用纱布过滤,加入吐温一80和咖啡酸.咖啡酸用少量95%乙醇溶解.混合均匀后分装试管,高压灭菌,115%,4.5kg,10rain,取出后置斜面.用时将待鉴定酵母接种于咖啡酸米粉琼脂,置25培养
42、.1872h菌落变褐或黑色为阳性.其他隐球菌或酵母不变色为阴性.以白念珠菌和新生隐球菌为阴性和阳性对照.5.9尿素酶试验用途新生隐球菌等一些隐球菌和一些酵母能够产生尿素酶.而许多其他酵母包括念珠菌属中的一些种却不能产生尿素酶,这个特性构成酵母鉴定,鉴别的依据之一.尿素酶能分解培养基中的中国真菌学杂志2010年l0月第5卷第5期ChinJMvcol,October2010,Vol5,NO.5尿素,并形成大量的氨,使培养基pH值升高而呈碱性,酚红指示剂因而变红.方法将待鉴定酵母接种于尿素琼脂斜面上.另接种一管新生隐球菌作为阳性别照.置室温培养3d,每天观察颜色变化.结果培养基呈粉红色或鲜红色为阳性
43、,说明有尿素酶产生.若培养基颜色不变或仅为黄色,判为阴性,表示有酸产生.注意一些尿素酶阳性的细菌污染也有可能产生阳性结果.尿素琼脂(chhensenureaagar)的配方葡萄糖10.0g,琼脂20.0g,蛋白胨1.0g,NaC15.0g,KH2PO2.0g,酚红0.012或0.02%水溶液6mL,蒸馏水1000mL,20%尿素液(后加).各成分混合均匀后调pH至6.8.加入琼脂20g煮沸至琼脂完全溶解,置高压消毒,4.54kg(10磅)10min.取出后冷却至4550时,每450mL培养基中加入抽滤灭菌的20%尿素溶液50mL;混合均匀后分装置斜面,冷后备用.皮肤癣菌的尿素酶试验也用此培养基
44、,但葡萄糖的浓度不是1%而是5%.用于鉴别红色毛癣菌和须癣毛癣菌,后者能在7d内使培养基变红.5.10水解淀粉试验方法使用淀粉培养基.取2个平皿各接种待鉴定苗种,另取一平皿接种已知菌种作为阳性对照.将平皿置25或37培养,视该菌最适生长温度而定.菌落生长成熟后,取一待鉴定平皿,倒人95%乙醇10mL.若菌落四周有明显的圈,为阳性,说明该菌能水解淀粉.若无明显的圈,第2周再检测第2个平皿.如果仍为阴性,而对照为阳性则判为阴性.若对照也为阴性,需重做该实验.淀粉培养基(starchmCUlTI)配方蛋白胨5.0g,牛肉浸膏3.0g,琼脂15.0g,蒸馏水1000mL.马铃薯淀粉10.0g,蒸馏水4
45、00mL.制备将组成分混合均匀,加热至沸,待琼脂完全溶解.将组混合均匀,倒入已溶化的组内,混合均匀.高压灭菌,分装平皿,冷却凝固后备用.5.11分解杨梅苷试验用途该试验检测酵母葡萄糖苷酶的活性,用于属的鉴别,包括汉逊酵母属(Hansenula),季也蒙酵母属(Guilliermondia),念珠菌属,酵母属,毕赤酵母属(pichia)等.方法将试管内备用的杨梅苷琼脂加热融化,加入一滴无菌的10%FeCI.混合均匀后置斜面.凝固后接种待鉴定菌株,置室温培养1周,观察结果.如果培养基变为褐色,判为阳性,说明该菌株能分解杨梅苷.杨梅苷琼脂(arhutinagar)杨梅苷0.5g,水洗琼脂2.0g,10%豆芽汁100mL.豆芽汁加入琼脂,加热溶化后再加入杨梅苷,混合均匀后分装于大试管,高压灭菌后备用.5.12石蕊牛奶试验用