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1、干血滤纸片试剂盒和水煮法提取间日疟原虫DNA用于PCR检测的比较蚌埠医学院2011年8月第36卷第8期文章编号1000-2200(2011)08-0793-03干血滤纸片试剂盒和水煮法提取间日疟原虫DNA用于PCR检测的比较793?基础医学?胡明洁,吴守伟,刘辉,张静,方强.,沈继龙摘要目的:比较水煮法和干血滤纸片基因组DNA分离试剂盒提取间日疟原虫DNA用于PCR检测及克隆研究的差异.方法:采集间日疟患者末梢血制备干血滤纸片,分别用水煮法和QIAampDNAminikit试剂盒提取间日疟原虫基因组DNA10份.PCR扩增LDH基因,并克隆质粒pGEMPvLDH.分析比较2种提取方法的差异.结
2、果:水煮法和试剂盒法提取的间日疟原虫gDNA,均扩增出LDH基因特异条带,但试剂盒提取的gDNA目的条带亮于水煮法.结论:水煮法操作简便,快速,经济,在等量血源条件下,所得DNA量较少,纯度较低;试剂盒提取可获得较高的得率,在定量检测和复合扩增时受到的影响因素较少,成功率较高.关键词间日疟原虫;DNA提取;干血滤纸片;聚合酶链式反应中国图书资料分类法分类号R382.31文献标识码AAcomparativestudyofdriedbloodspotgenomicDNAisolationkitandboilingmethodinDNAextractionandPCRdetectionofPlasm
3、odiumvivaxHUMing-jie,WUShouwei,LIUHui,ZHANGJing,FANGQiang,SHENJilong(.DepartmentofMicrobiology,AahuiMedicalUniversity,HefeiAnhui230031;2.DepartmentofBioscience,3.DepartmentofMicrobiology,BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui,233030,China)Abstract0bjecfive:Tocomparethedifferencesofdriedbloodspot(DBS)genom
4、icDNAisolationkitandtheboilingmethodinDNAextraction,PCRandcloningofPlasmodiumvivax.Methods:Theperipheralbloodwascollectedfromvivaxmal耐apatientsandthedriedbloodspotswereprepared.ThegenomicDNAoftensampleswasextractedwithboilingmethodandQIAampDNAminikit(QIAGEN,Germany).Thelactatedehydrogenase(LDH)genew
5、asamplifiedbyusingtheextractedDNAastemplate.TheamplifiedfragmentwaspurifiedandclonedintopGEMvector.Thedifferencesofbothmethodswereanalyzedandcompared.Results:ThetargetfragmentofLDHgenewasamplifiedwiththegDNAextractedbythebothmethods;buttheelectrophoreticbandswiththetemplatebykitmethodwereobviouslybr
6、ighterthanthatbyboilingmethod.Conclusions:Theboilingmethodisasimple,rapidandeconomicalwayinextractinggDNAfromthedriedbloodspots;butinagivenamountofbloodsample,theextractionrateandpurityofDNAarelower;whiletheextractionkit,withahigherextractionrate,islessaffectedbyinthequantitativeanalysisormuhiplexPC
7、R.KeywordsPlasmodiumvivax;DNAextraction;driedbloodspots;polymerasechainreaction疟疾是一种严重危害人类健康的感染性疾病,据WHO2010年发布的数据显示,全球受到间日疟原虫感染威胁的人口高达26亿,我国大部分流行区均以间日疟流行为主.因为不会导致类似于恶性疟的高病死率,问日疟常常被认为是一种良性疟疾,所以间日疟原虫的危害一直以来被低估.但近年来收稿日期2011_27基金项目教育部科学技术研究重点资助项目(211079);蚌埠医学院科研基金资助项目(BY0815)作者单位1.安徽医科大学病原生物学教研室,安徽合肥230
8、031;蚌埠医学院2.生物科学系,3.病原生物学教研室,安徽蚌埠233030作者简介胡明洁(1972一),女,讲师.通讯作者沈继龙,博士,博士研究生导师,教授;方强,博士,硕士研究生导师,教授.研究发现,间日疟如果反复发作可导致患者虚弱,并可引起诸如脑型疟,急性呼吸窘迫综合征,肝脏功能衰竭,循环衰竭,严重贫血等危及生命的并发症.分子生物学技术用于疟原虫感染检测及不同种类疟原虫鉴别,具有操作简便,特异性强,敏感度高等优点.供PCR扩增的疟原虫DNA模板,一般通过静脉取血由疟疾患者的感染红细胞获得.但现场静脉采血常常存在着一定的困难,血样的运输及保存亦欠方便.滤纸干血片标本具有制作简单,需血量少,
9、保存运输方便等优点,生物安全性高,适合大规模间日疟筛查工作的开展,临床应用广泛.本文介绍以间日疟原虫的滤纸干血滴为材料,用2种不同的方法抽提微量DNA,通过PCR扩增间Et疟原虫794乳酸脱氢酶基因(Plasmodiumvivaxlactatedehydrogenase,P.vivaxLDH)特异性片段,并克隆质粒pGEMPvLDH,比较2种方法的差异.JBengbuMedColl,August2011,Vo1.36,No.8置于室温放置1.5h(每隔30min混合一下).13000r/min,离心3min,弃上清后按照QIAampMini全血提取试剂盒的说明书进行操作.1材料与方法2结果1.
10、1材料1.1.1间El疟原虫感染血样采自安徽省蚌埠市区,五河等地临床诊断为疟疾患者的末梢血,年龄18岁,非孕妇且体温39.5的患者.告知实验目的并签署知情同意书,制备厚/薄血膜,干燥,甲醇固定,吉姆萨染色,镜检计数红细胞感染率,筛选出确诊为单纯间日疟原虫感染患者.同时记录患者姓名,年龄,性别等自然情况以及主要症状,治疗情况等相关资料.取患者末梢血3大滴(每滴约151)于灭菌的滤纸上,室温干燥放人塑料袋密封,置于一20冰箱保存,供基因组提取用.1.1.2菌种和质粒pGEM-T载体购自Promega公司.大肠埃希菌E.coliDH.5为本室保存.1.1.3引物根据GenBank数据库中间日疟原虫B
11、elem株LDH基因序列(登录号:DQ060151)设计1对引物,上游引物为5.ATGACGCCGAAACCCAAAA1TrG-3,下游引物为5-TTAAATGAGCGCCTYCATCCT唧AG.3,引物由上海生工生物工程有限公司合成并ULTRAPAGE纯化.1.1.4主要试剂TaqDNA聚合酶,dNTP,dATP购自MBIFermentas公司,DNA提取试剂盒QIAampDNAMiniandBloodMiniKit购自QIAGEN公司,PrimeSTARTMHSDNAPolymerase试剂盒,限制性内切酶,T4DNA连接酶,1kbpDNALadderMarker,100bpDNALadd
12、erPlusMarker均购自Takara公司,琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒V3.0为道普生物公司产品,EB购自Sigma公司,琼脂糖购自Promega公司;其余试剂均为国产分析纯.1.2实验方法1.2.1水煮法取直径约1cm的滤纸干血滴置于1.5mlEppendorf管内,加6001生理盐水溶血,室温置15min,轻摇并弃溶血液,加6001双蒸去离子水洗涤,弃洗涤液,加1001双蒸去离子水煮15min,离心15min,取上清备用.1.2.2改良QIAamp提取gDNA将血样滤纸片剪至23枚,直径3mm左右,放人2.0mlEP管中.加入0.85%氯化钠溶液1.0ml,高速振荡510S,10份
13、间13疟原虫滤纸干血片经水煮和试剂盒2种间日疟原虫gDNA的提取后经PCR扩增,1.5%琼脂糖电泳试剂盒提取的(L1L3)均出现约1000bp特异性扩增条带,稍亮,以水煮法提取间日疟原虫gDNA为模板的第五泳道未见明显特异性条带(见图1).2000bp1000bp500bp100bpL1L3:试剂盒提取间日疟原虫gDNA;L4一L6:水煮法提取间日疟原虫gDNA:M:D2000DNAMarker图12种方法提取间日疟原虫gDNAPCR扩增电泳以试剂盒提取间日疟原虫gDNA为模板均成功经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后连接至pGEMT质粒,转化E.coliDH5a菌株后挑取菌落进行PCR鉴定,重组质粒p
14、GEM-P.vivaxLDH均扩增约1000bp的特异性条带,而以水煮法提取问日疟原虫gDNA为模板有的未能成功克隆.3讨论间日疟原虫虫株间的变异或抗原的多态性研究,常用PCR,套式PCR_6-8,荧光定量PCR9.等方法,但需静脉取较多量血样,给现场采集血样,保存及运输等造成一定困难.因而,发展一种简便,易于保存及运输的采血方法及效果较好的DNA提取方法普遍受到重视.干血滤纸法是一种简便,易于保存及运输的采样方法,通常适用于大样本的流行病学调查.如何从干血滤纸中有效提取足量的DNA,是比较重要的一步.我们把10份间日疟原虫滤纸干血片经水煮和试剂盒2种方法间日疟原虫gDNA的提取后PCR扩增,
15、1.5%琼脂糖电泳时,试剂盒提取为模板的均蚌埠医学院2011年8月第36卷第8期出现约1000bp特异性扩增条带,稍亮,以水煮法提取间日疟原虫gDNA为模板有的泳道未见明显特异性条带.这样在下一步需要基因克隆时,将无法进行转化后的菌落提取质粒.由本实验观察水煮法操作简便,快速,比较经济实用,但所得DNA量少,纯度不高,不宜长期保存,PCR扩增时也可能会因纯度和得率不理想而影响扩增效率,常常不能保证下一步实验克隆所需;但可用于学生做简单PCR实验,节省实验经费.而试剂盒提取可获得较高的得率,在定量检测和复合扩增时受到的影响因素较少,成功率较高,且均具有简便快速,省时省力的优势;然而,就成本而言,
16、试剂盒相对较高,用于科研较好.2种DNA抽提方法各有利弊,可根据实际情况的不同,选择适用的DNA提取方法,快速,经济,安全和高效地从干血滤纸中提取基因组DNA,以满足科研或教学工作的需要.参考文献1周水森,王漪,房文,等.2007年全国疟疾形势J.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2008,26(6):401403.2deLaeerdaMV,ZackiewiczC,AlecrimWD,eta1.TheneglectedPlasmodiumvivax:areresearchersfromendemicareasreallyconcernedaboutnewtreatmentoptionsJ.RevSo
17、cBrasMedTmp,2007,40(4):489490.3GalinskiMR.BarnwellJW.Plasmodiumvivax:whocaresJ.795MalarJ,2008,7(Supp1):59.CarhonJM,AdamsJH,Silvajc,eta1.ComparativegenomicsoftheneglectedhumanmalariaparasitePlasmodiumvivaxJ.Nature,2008,455(7214):757763.AnsteyNM,RussellB,Yeo,eta1.ThepathophysiologyofvivaxmalariaJ.Tren
18、dsParasitol,2009,25(5):220227.NdaoM,BandyayeraE,KokoskinE,eta1.Comparisonofbloodsmear,antigendetection,andnested?PCRmethodsforscreeningrefugeesfromregionswheremalariaisendemicafteramalariaoutbreakinQuebec,CanadaJ.JClinMicrobiol,2004,42(6):26942700.徐军强,袁方玉,詹发先,等.套式PCR检测恶性疟原虫与间日疟原虫方法的建立及其应用研究J.公共卫生与预防
19、医学,2009,20(2):1114.郭传坤,黎学铭,李锦辉,等.套式/多重PCR诊断疟疾的敏感性,特异性和稳定性初探J.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2007,25(3):213216.KhairnarK,MartinD,LauR,eta1.Multiplexreal-timequantitativePCR,microscopyandrapiddiagnosticimmuno-chromatographictestsforthedetectionofPlasmodiumspp:performance,limitofdetectionanalysisandqualityassuranceJ.Ma
20、larJ,2009(8):284.VeronV,SimonS,CarmeB.MultiplexrealtimePCRdetectionofP.falciparum,P.vivaxandP.malariaeinhumanbloodsamplesJ.ExpParasitol,2009,121(4):346351.(本文编辑姚仁斌)蚌埠医学院征订启事蚌埠医学院创刊于1976年3月,由安徽省教育厅主管,蚌埠医学院主办,国内外公开发行的综合性医学学术期刊.主要刊登实验医学论文和应用医学论文.设有述评,基础医学,大学生科技园地,临床医学,检验医学,影像医学,药学,预防医学,祖国医学,精神卫生,护理学,技术
21、与方法,综述,个案报道等栏目.本是中国科技论文统计源期刊(中国科技核心期刊),中国学术期刊综合评价数据库统计源期刊.中国科技论文与引文数据库,中国期刊全文数据库,中国核心期刊(遴选)数据库,中国生物医学光盘数据库(CBMdisc),中文生物医学期刊文献数据库(CMCC),中文科技资料目录一医药卫生,中国生物学文献数据库,中国生物学文摘和中国医学文摘(十余种)等收录本.并已进入美国化学文摘(CA)检索系统.全文入编中国学术期刊(光盘版),中国知网,万方数据一数字化期刊群等.先后获全国高校优秀科技期-71J(B类)二等奖,安徽省高校优秀二等奖,安徽省优秀科技期刊三等奖.本现为月刊,每月15日出版,国际标准A4开本,1l2页,铜版纸印刷.标准刊号:ISSN1000.2200;CN34.1067/R;CODEN:BYIXEM.邮发代号:26-37,每册定价8.o0元,全年96.00元.欢迎广大读者及时向当地邮局订阅,也可直接向本刊编辑部订阅,免收邮寄费.邮购地址:安徽省蚌埠市东海大道2600号邮政编码:233030电话:(0552)3175456http:/Email:;byxb163.corn蚌埠医学院编辑部1J1jJJ1J1Jm