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1、怎么样稀释一抗我应使用浓度多高的一抗？对于我们注明“稀释度根据实验而定”的抗体，较难找到一个起始点。以下图表根据产品的纯度以及抗体将进行的应用提供了一些供使用的起始稀释度。未纯化的抗体在数据表中不会注明浓度。对于大多数全抗血清、培养物上清液或腹水产品，浓度尚未确定。未纯化的抗体制品在具体抗体浓度上差异很大。如果给定的未纯化抗体制品的具体抗体浓度未知，可以把下面的“浓度估值”区作为估算依据。请记住这些稀释度和浓度估值仅推荐用作起始点，有必要根据实验结果调整稀释度。组织培养上清液腹水全抗血清纯化抗体WB / 斑点杂交1/1001/10001/5001 ug/mlIHC / ICC纯的- 1/101
2、/1001/50- 1/1005 ug/mlEIA / ELISA1/10001/100001/5000.1 ug/mlFACS / 流式细胞术1/1001/10001/5001 ug/mlIP1/1001/50-1/1001- 10 ug/ml浓度估值1- 3 mg/ml5- 10 mg/ml1- 10 mg/ml简单说几句，封闭血清的原理主要有两点，第一是待检样本会非特异性的和蛋白结合，从而导致背景过高，因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，BSA和血清没有明显区别。第二是待检样本中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区结合，与抗体特异性无关，封闭血清中有抗体，因此用血清
3、可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。不能用来自一抗同物种的血清举个例子就清楚了，比如一抗是鼠抗人的抗体，二抗是兔抗鼠的抗体，你要用鼠血清封闭的话，二抗就和封闭用的鼠血清里面的鼠抗体反应了，那不就假阳性了嘛。先加一抗后再封闭的话，一抗就会结合到固相表面上，这种结合力是非特异性的疏水作用力，这种作用力是比较强的，经过处理的固相表面如硝酸纤维膜，酶标板对蛋白的吸附力更强，你再去封闭就没有作用了。当然，也不是说封闭蛋白就完全不会封闭掉一抗的蛋白结合位点，在蛋白过量的条件下，蛋白质之间会有黏附和堆积作用，但这种作用通常是不稳定的。如果你所选择的一抗与固相抗原亲和力较高，
4、在适合的buffer条件下，一抗会竞争它的结合位点。蛋白质之间那点黏附和堆积作用力当然竞争不过它啦。下面是从书上摘下的几句话，希望对你有帮助： 组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第 二抗体动物之非免疫血清(1:51:20) 封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入 2%5% 牛血清蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为 1020min。 也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清 (非免疫的)。有明显溶血的血清不能对消除背景的非特异性染色有很好的效果。当然使用特异性
5、高、效价高的第一抗体是最重要的条件。抗原-抗体是免疫球蛋白分子上的抗原结合簇与抗原分子上的抗原决定簇相互吸引以及多种分子间的引力参与发生的。这种反应没有化学键的形成。抗原-抗体的结合是可逆的“DMEM:f12和BSA？可能BSA是用来包被的，如果只含有DMEM/F12和BSA肯定不能养出活细胞。你可以买Amresco或者Roche的BSA 组分v，95%纯度，冷醇法提取的。实际上FBS的主要成分就是BSA，只是还含有其它的一些生长因子和激素类的物质罢了。你用FBS即可。用多聚赖氨酸包被平皿同样也可以培养气管上皮。免疫组化封闭血清的选择和使用做免疫组化时，一般都会封闭。以减少假阳性。封闭主要是用
6、于封去切片上一些非特异性吸附。用一种非特异性的蛋白，把那些容易吸附蛋白的空间和位点占起来，这样，加上抗体时，抗体只能与对应的抗原去结合了。一般封闭可以用5%的BSA，这个价格便宜，而且效果还行。但理论上，用与二抗同来源的正常血清会更好。比如，一抗为国产的兔抗IL-2，二抗用标记的羊抗兔IgG。那么，封闭血清就选择与二抗同来源的正常羊血清（一般为山羊）。而同理，如果一抗为羊抗IL-2，二抗可以选标记的兔抗羊IgG，封闭血清选择正常兔血清。使用时，可以用PBS将正常血清稀释20倍，直接滴加在切片上，37度10-30分钟，直接甩掉，不洗，轻轻的吸一下旁边的液体，再加一抗。听说4过夜比起37两小时背景
7、会干净一些。当然，时间也会长一些。关于抗体质量，我觉得yeasen公司的二抗质量还是不错的，比起进口的来丝毫不差，但一抗，也许种类太多，我们要努力的路还很长。虽然有很多进口的二抗是国内给加工的，而且还不少，但相对抗体的种类还说，还是很少。常用封闭血清/BSA/脱脂奶粉：现货货号货品名称产地价格/规格017-000-121封闭用正常驴血清Normal Donkey SerumJackson800元/10ml011-000-120封闭用正常兔血清Normal Rabbit SerumJackson528元/5 ml015-000-120封闭用正常小鼠血清Normal Mouse SerumJack
8、son704元/5 ml005-000-121封闭用正常山羊血清Normal Goat SerumJackson800元/10ml0218054980封闭用BSA（标准级）MPbio830元/100gLP0031封闭用脱脂奶粉Oxoid320元/500g各论坛网友对具体的稀释方法的建议流式细胞抗体稀释剂：0.1mmol/L PBS液（PH 7.4）1BSA0.1Na2N3。1x 的PBS 就是0.1mmol/L流式最好用直标，间标非特异性太高，直标的话，每管+3-5ul的抗体就很好，间标时只需要稀释二抗，根据二抗说明书的要求稀释如果是即用，PBS和抗体稀释液都一样，如果不是，则建议用抗体稀释液
9、。PBS稀释的抗体不能较长时间保存（通常在12周内就得使用完），专用抗体稀释液稀释后的一抗通常可以较长时间保存。按说明书操作！根据实验室具体情况适当调整稀释比（可能需要预实验摸索最佳稀释比，设置阳性和阴性对照）。用前取1微升，加到要稀释的倍数体积的PBS内就可以了，每次现用现配，不能一次把所有的都稀释。对。 1:100 稀释就是1ul抗体 + 99ul 0.1%PBS。或者1ul抗体 + 99ul 抗体稀释液。用抗体稀释液或PBS稀释稀释后的抗体最多能保存不要超过两周时间.如果需要长期保存, 只要将没有稀释的一抗浓缩液放在摄氏4度的冰箱里就可以了.这样至少可以保存两年.想要长时间保存抗体，最好
10、用封闭血清稀释。可以用抗体稀释液,也可用PBS液但是保存时间不长要现用稀释液自己配制也不难的!我的封闭液、一抗、二抗的稀释液用的都是自己配制的，染过多次。效果不错！大家可以试试，有什么建议可以改进：1、0.01M的PBS，里面加0.3%triton-100（有穿透细胞的作用，我用0.3%的就很好，大家可以再加强浓度！）2、以上是可以事先配制好的，在4度冰箱待用，但是时间不要过长，三个月以内吧。3、之后就是在每次稀释抗体的时候加10%NGS（牛血清），这步最好现用现配。都配制好再加入抗体，就可以了。大家可以试试看，这样的话可能就是买牛血清的时候稍微贵一点，我们用的是中杉的，其余的PBS什么的，都
11、是实验室的耗材，长备的，我觉得还是比买现成的稀释液省钱，关键是效果也很好！出现非特异染色和你用什么来稀释一抗关系不是很大。主要是在试验过程中尽量减少非特异染色的出现。血清封闭、内源性酶的封闭时间要自己摸一下，楼上说的时间有点长，封闭时间太长会降低一抗的染色。一抗的稀释比例要按照试剂说明，自己进行抗体浓度梯度测试后确定。另外洗涤、脱蜡不充分等也可以增加非特异染色，你要根据情况进行调整。优化抗体稀释度：滴定实验最佳滴度或稀释度为在最少背景/非特异性结合的情况下得到最佳染色效果的浓度（稀释度）。必须通过实验确定每次测定的最佳抗体浓度。通常通过在滴定实验中使用一系列稀释度来确定。当实验室收到一种新抗体
12、时，建议尝试用滴定实验确定最佳抗体稀释度以获得最佳结果。例如，如果产品数据表建议使用 1:200 的稀释度，则可尝试制备 1:50、1:100、1:200、1:400 和 1:500 的稀释度，借此确定适合单独实验室和样品条件的最佳稀释度。要进行滴定实验，首先要选择固定的孵育时间。然后制备一系列实验稀释度的抗体以备测试。每种稀释度应针对相同类型的样品进行测试，以保持实验条件标准化。许多抗体批间性能差别不大，因此您只需要进行一次滴定实验。但是，多克隆抗血清抗体浓度在不同动物间或不同血清采集时间可能显著不同。在这些情况下，或者当您注意到任何抗体的批次间染色结果有变化时，我们推荐再次对该瓶抗体进行滴
13、定实验以获得最佳浓度。数据表上无推荐稀释度的抗体的建议稀释度：未纯化抗体制备物在特定抗体浓度方面差别很大。如果给定未纯化抗体制备物的特定抗体浓度未知，可参考下列“典型范围”作为估算依据：此表提供了使用各种形式抗体时用于各应用的参考稀释度：组织培养物上清液腹水全抗血清纯化的抗体WB/dot blot1/1001/10001/5001 ug/mlIHC/ICC未经稀释 - 1/101/1001/50 to 1/1005 ug/mlEIA/ELISA1/10001/100001/5000.1 ug/mlFACS/Flow Cytometry1/1001/10001/5001 ug/mlIP?1/1001/50-1/1001 to 10 ug/mlIgG 浓度大致估算1 to 3 mg/ml5 to 10 mg/ml1 to 10 mg/ml