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1、布鲁氏菌 BtpB 缺失株构建及其对山羊肺泡巨噬细胞NLRP3炎性体的影响布鲁氏菌感染引起的布鲁氏菌病是严重危害我国奶业发展的人兽共患病 , 由于缺乏安全可靠的疫苗和鉴别诊断手段, 一直备受人们关注。深入揭示布鲁氏菌的致病机制, 是研发新疫苗和有效防控手段的关键 , 也是该病目前研究的热点。布鲁氏菌以肺泡巨噬细胞为靶细胞, 在其中复制并干扰巨噬细胞的功能。布鲁氏菌有多种免疫逃避机制, 干扰模式识别受体 (pattern-recognition receptors,PRRs)的识别是其隐秘进入宿主细胞及抑制固有免疫反应的关键。BtpB 是依赖布鲁氏菌型分泌系统分泌的一种效应分子, 也是目前已知的
2、主要毒力因子之一。 NLRP3(NOD-like receptor family member pyrindomain-containing protein 3)作为一种胞内模式识别受体, 在病原体入侵的固有免疫反应中发挥重要作用, 由其装配形成的NLRP3炎性体是一种存在于胞浆中的大分子多蛋白复合物, 能够感知病原微生物感染、组织损伤和代谢失衡时所释放的分子信号。NLRP3激活后促进IL-1 等炎性因子的成熟和释放 , 促进多种免疫相关基因的表达 , 并募集淋巴细胞至感染部位 , 从而抑制病原微生物感染。 研究表明 , 布鲁氏菌感染期间 , 其型分泌系统效应分子 BtpB 能以多种方式干扰宿
3、主的天然免疫应答 , 其中干扰 TLRs信号传导 , 进而抑制下游免疫级联反应是主要方式之一。模式识别受体感受病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs) 后会引发 NLRP3 炎性体的激活 , 然而 BtpB 作为布鲁氏菌的 TIR 结构域蛋白与 NLRP3炎性体之间的关系仍不清楚, 其发挥免疫调节功能的机制也有待进一步研究。为揭示 IV 型分泌系统效应分子BtpB 与布鲁氏菌生长表型及其与 NLRP3炎性体活化的关系。 本研究通过基因编辑技术构建布鲁氏菌S2株(B.suis S2)BtpB 缺失株及其互补株 ; 经扫描电镜观察
4、 B.suis S2、 BtpB 缺失株和互补株的菌体形态 , 测定生长曲线 , 及其在酸、热、高渗、氧压力等应激条件下生存率等差别 , 检测 BtpB 对布鲁氏菌生长特性的影响 ; 通过细胞试验 , 利用 qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光等相关技术检测BtpB 对 B.suis S2侵染山羊肺泡巨噬细胞后模式识别受体、 NLRP3炎性体组分以及相关炎性因子表达的影响。试验结果如下 :1. 分别以复苏的 B.suis S2和 pBBR1MCS5为模板 ,PCR扩增BtpB 上下游同源臂和庆大霉素基因, 将三段扩增产物连接到pUC19载体上 , 构建重组质粒 pUC19G-
5、BtpB。酶切、测序鉴定正确后 , 电击转入B.suis S2 感受态细胞。经庆大霉素抗性筛选、PCR鉴定获得 BtpB 缺失株。 PCR扩增 BtpB 基因 , 将其连接到表达载体pBB-PZT1上, 构建重组质粒 pBB-PZT1-BtpB。测序正确后 , 将其电击转入 BtpB 缺失株感受态细胞中 , 利用羧苄抗性筛选阳性克隆, 经 Western blot鉴定正确后获得 BtpB 互补株。 2. 扫描电镜观察 B.suis S2 、BtpB 缺失株和互补株的形态 , 发现 BtpB 对布鲁氏菌形态无显著影响。 通过检测 B.suis S2、BtpB 缺失株和互补株的生长曲线及其在山羊肺
6、泡巨噬细胞内的增殖,发现三株菌的胞外及胞内增殖曲线均无显著差异。测定在酸、热、高渗、氧压力等应激条件下三个菌株的生存率, 发现与原始菌株和BtpB基因互补株相比 , 缺失株在氧化应激条件下生存率增加。3. 通过qRT-PCR、免疫荧光、 Western blot和 ELISA 检测发现 :BtpB 缺失株处理组 ,GAMs细胞 TLR2、TLR4表达量上调 , 与 B.suis S2处理组和互补株处理组相比 , 差异显著 ;BtpB 缺失株处理组 NLRP3炎性体相关组分 NLRP3、ASC和 caspase-1 表达量显著升高 ; 同时 ,NLRP3炎性体下游细胞因子 IL-1 表达量显著增加 , 差异极显著。以上结果表明 ,BtpB对布鲁氏菌 S2 株生长特性无显著影响, 在布鲁氏菌抑制宿主固有免疫的过程中可能通过NLRP3炎性体途径发挥作用。