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1、酵母细胞表面展示技术及其在高通量筛选中的应用,目录,酵母细胞表面展示技术的概述 酵母细胞表面展示技术在高通量筛选中的应用,酵母细胞表面展示技术的概述,酵母细胞表面展示技术的概述,酵母细胞表面展示技术(Surface Display)是一种真核蛋白表达系统。它是一类筛选蛋白质突变体库的高通量 筛选方法，在抗体蛋白的研究中应用尤 其广泛，具有高效、灵敏等特点，在医 药、食品、生物燃料等多个工业领域都 有广泛的应用前景。,基本原理：是将外源靶蛋白基因与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，用酵母细胞内蛋白转运机制将目的蛋白转移至细胞表面并且固定在细胞膜上。与其它表面展示系统相比,酵母表面展示系统可克
2、服真核蛋白在原核细胞表达时活性降低或失活的缺点。,最常见的酵母表面展示表达系统包括: 凝集素展示表达和絮凝素展示表达,是将外源基因与酵母编码-凝集素C端编码序列(含GPI锚定信号序列)连接后插入质粒载体的信号肽下游,融合蛋白诱导表达后,信号肽引导嵌合蛋白向细胞外分泌, 由于融合蛋白C-末端存在含GPI锚定信号的凝集素多肽序列 ,可将蛋白锚定在酵母细胞壁中,从而将蛋白分子展示表达在酵母细胞表面。,凝集素展示表达,凝集素系统又分为-凝集素(Ag)系统和a-凝集素(Aga) 系统,在-凝集素系统中，凝集素的 C 端可锚定在酵母细胞壁的葡聚糖上，外源蛋白作为N端与凝集素C端融合，在信号肽引导下分泌表达
3、，从而实现了外源蛋白的展示表达。,a-凝集素是 Agalp 和Aga2p亚单位通过二硫桥相连，其中 Agalp 通过-葡聚糖共价连接在细胞壁上，目的蛋白与Aga2p的N端融合表达后，再通过Agalp与酵母细胞壁的共价连接而展示在细胞表面。,絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因与外源蛋白融合,并将融合蛋白展露表达在细胞表面，此系统又包括两个子统:GPI锚定系统和絮凝结构域锚定系统。,GPI锚定系统是利用絮凝素FLo1p的 C -末端含有的GPI信号锚定外源蛋白,此系统与凝集素展示相似。,絮凝结构域锚定系统是利用 FLo1p的中间絮凝功能结构域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识别酵母细胞壁中的甘露聚
4、糖链并非共价作用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物。,絮凝素展示表达,酵母表面展示技术的特点,表达偏差小,融合蛋白相对分子质量范围大,筛选、纯化、活性测定方便,融合蛋白分子数量多,特点,酵母表面展示,酵母表面展示系统的应用,酒精发酵,生物吸附,高通量筛选,为了简化纤维素乙醇生产工艺，实现纤维素利用与乙醇发酵的同步进行，莫春玲等通过酵母细胞表面展示技术，以酿酒酵母菌株 Saccharomyces cerevisiae Y5 为受体，通过絮凝素 (Flo1p) 锚定方式，将来自丝状真菌里氏木霉 Trichoderma reesei 的内切葡聚糖酶(EGII)、纤维二糖水解酶(CBHII)以及来自棘孢
5、曲霉 Aspergillusaculeatus 的 -葡糖苷酶(BGLI) 展示在细胞表面，构建同时表达 3 种纤维素酶的酵母菌群系统。 经过免疫荧光验证展示酶的细胞蛋白定位，酶活测定，乙醇发酵性能验证，结果表明：展示表达的3种纤维素酶具有良好的稳定性和功能活性；,乙醇发酵,该系统已经得到成功开发，但是在这一领域里仍有许多亟待解决的问题，例如：展示在细胞表面的纤维素酶的活性与游离酶相比有所下降；成功展示的纤维素酶稳定性有待提高。,即使如此，利用酵母表面展示技术表达纤维素酶的新型酵母菌群进行纤维素乙醇发酵效果还不是很理想，乙醇产率较低，难以满足实际生产需求。,在EGII、CBHII和BGLI协同
6、作用下重组酵母菌株能够水解溶胀磷酸纤维素 (Phosphoric acid swollen cellulose，简称 PASC)并产生乙醇，乙醇浓度达到最大值0.77 g/L，乙醇产量为 0.35 g/L，相当于理论值的68.6%。,酵母细胞表面展示技术在高通量筛选中的应用,高通量筛选,什么是high-throughput screening,高通量筛选（HTS）又称大规模集群式筛选，是由高容量化合物库、自动化操作、高灵敏度检测、高特异筛选模型、高效率数据处理5个子系统有机组合而成，是一种新型的筛选技术。,高通量筛选的技术过程,1、样品库 2、初筛和复筛 3、活性化合物 4、深入筛选 5、获得
7、少量先导化合物 6、确证筛选药物药理学研究 7、侯选药物 8、临床前研究,药物筛选,定向进化,酵母展示在高通量筛选中的应用,药物筛选,把酵母应用于药物筛选，最早始于利用酵母双杂交技术来确定药物靶点。 随之发展起来的基于靶点的药物筛选至今已有大量成功先例。,选择的靶点基本上可分为四种类型： 离子通道、核受体、G 蛋白偶联受体(GPCRs)和酶。,直接活性筛选 可通过酵母系统直接进行化合物活性筛选，这主要源于两种情况: (1)在离子转运缺陷的酵母菌株中重建人的离子通道，会产生补充生长的表型； (2)在酵母中表达离子通道蛋白可导致酵母生长缺陷。 在筛选离子通道抑制剂时，前种情况可筛选那些导致酵母生长
8、受抑的化合物，而后种情况下则可筛选那些能使酵母细胞恢复生长的化合物。,离子通道,Hahnenberger和Kurtz 建立了酵母展示的系统来筛选钾离子通道、质子通道和钠/氢离子通道的抑制剂。其中，流行性感冒质子通道蛋白M2的表达能导致酵母生长缺陷，因此，理论上那些能使酵母恢复生长的化合物就是M2的抑制剂。据此，他们筛选得到了一个流行性感冒质子通道蛋白的抑制剂。此外，在利用生长抑制的方法进行抑制剂筛选实验中，由于那些具细胞毒性的化合物虽然不是离子通道抑制剂，也能阻碍酵母生长。为此，Hahnenberger和Kurtz设计了微生理测量计，能检测出反映离子通道功能的pH变化，为假阳性的剔除提供了一个
9、快速的二次检验方法。,酵母双杂交筛选 由于离子通道蛋白是多亚基结构，亚基间的作用一旦被破坏，离子通道的功能就会受到影响，因此，利用酵母双杂交可筛选那些破坏亚基间相互作用的化合物，即该离子通道的抑制剂。 Young等成功筛选得到了能抑制N-型钙离子通道3亚基和1B 亚基间相互作用的化合物，且这些化合物在随后的功能性实验中的确表现出了钙离子通道抑制剂的活性。这些工作不仅成功地将酵母双杂交应用于药物筛选，而且还把酵母双杂交成功地引入到膜蛋白相互作用的研究中。,核受体,Taniguchi等建立了一个酵母双杂交系统来筛选人过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPAR)的激动剂与半激动剂。,G蛋白偶联受体,在此类
10、筛选中，工程酵母中的酵母接合信息素受体Ste2p 为人的G蛋白偶联受体(GPCRs)所取代，同时在可筛选的报告基因上游引入接合特有的启动元件。这种工程酵母可用于高通量筛选人G 蛋白偶联受体(GPCRs)的半激动剂和激动剂。,一般来说，酶通常不需要几个蛋白共同作用来发挥其功能，且酶的结构各异，因此，酶抑制剂的筛选比以上几种蛋白要困难得多。,酶,通常被选的展示系统应该满足以下几个条件： 1. 表达偏差应该是最小的，以便DNA库的多样性可代表正确折叠蛋白质的多样性。 2. 要有定量筛选的标准。 3. 被选系统必须能很好的区分仅有微弱亲和力差别的突变体。,定向进化,为什么要通过酵母细胞展示进行高通量筛
11、选,1. 虽然噬菌体表面展示在抗原表位分析、抗体筛选、抗体酶和蛋白酶抑制剂研究 等方面得到广泛、成功的应用，但是噬菌体表面展示利用原核表达系统，不能展示需糖基化、二硫键异构化等翻译后修饰才表现功能活性的复杂真核蛋白 。,2. 酵母表面展示系统弥补了噬菌体展示技术的此项不足 ,能使复杂真核蛋白得到展示, 同时又保留了噬菌体表面展示技术的便于筛选、 扩增等优点 。,1. 酿酒酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似，因而比原核细胞更能正确表达和展示人的蛋白质。 2. 与噬菌体不同，酵母是个足够大的颗粒，可用流式细胞仪进行筛选和分离，这就使得基于特异定量亲和力改变的突变体分离成为可能。 3. 由于酵母展示的蛋白质是紧密锚定在细胞壁上，可以耐受SDS等的抽提，同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上具有很好的应用前景。 4. 在应用过程中，细胞表面展示技术结合流式细胞仪在筛选的高通量和测定单细胞水平的酶动力学之间达成很好平衡。甚至在高密度的固体形态或微量滴定量L板测活，也能准确定量酶的活力。,酵母细胞展示系统在高通量筛选应用中的优点,综上所述，基于酵母展示系统的高通量筛选技术在工业应用上的前景将非常广阔。,THANKS,