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1、第一章,工具酶(Enzymes ),本章主要内容,限制性内切酶 甲基化酶 DNA聚合酶 其他分子克隆工具酶,限制与修饰(restriction an modification) 限制性内切酶识别的序列 限制性内切酶产生的末端 末端长度对切割的影响 位点偏爱 (site preferences) 酶切反应条件 星星活性(star activity) 单链DNA的切割,1.1 限制性内切酶,1.1.1 限制与修饰,50年代初，发现寄主控制的专一性( host controlled specificity)， 噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时受到限制。,说明K和B菌株中存在一种限制系统(r
2、estriction system),可排除外来的DNA; 10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果; 甲基化：A N6甲基-腺膘呤 C 5甲基-胞嘧啶,1.1.2 限制性内切酶,1970年 美国约翰霍布金斯大学 H.Smith偶然发现流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA(phage DNA),其细胞提取液可降解E.coli DNA,但不能降解自身DNA，即HindII酶。 识别位点 5 .G T Py Pu A C. 3 3C A Pu Py T G. 5,G T C G A C G T T A A C G T C A A C G T T
3、 G A C,Y R,限制酶的命名,宿主： 属名第一字母、种名头两个字母 菌株或生物型号 序号： 罗马字,EcoRI GAATTC HindIII AAGCTT,依据亚单位(subunit)组成、识别序列(recognition sequence)的种类和是否需要辅助因子(cofactor)分类； Restriction Enzymes 3744种 Type I 1%（既修饰又切割） Type II 93%（回文序列） Type IIs 5%（非分文序列） Type III 1%（识别和切割位点相距较远）,限制修酶的分类,type II （93%）,识别回文序列(palindromic seq
4、uence)， 一般4-6bp，但有少数酶识别更长的序列或简并序列(degenerate sequence)； 在回文序列内部或附近切割，切割位置因酶而异，产生带3-OH和5-P基团的DNA的产物； 需Mg2+,type IIs （5%）,识别位点(recognition site)非对称，4-7bp； 切割位点可能在识别位点一侧20bp范围内； 与 type II 具有相同的辅助因子(cofactor)要求。,type I （1%）,R酶和M酶，另外还有负责识别DNA序列的S亚基，各作为一个亚基存在于酶分子中； 分别由hsdR，hsdM，hsdS基因编码，属于同一操纵子(operon)（转录
5、单位）； EcoK，R2M2S； EcoB，R2M4S2,识别位点(recognition site) EcoB TGA*(N)8TGCT A* EcoK AA #C (N) 6GTGC A# *甲基化位点；#可能的甲基化位点 切割位点1000bp以外，无特异性,typeIII (1%),如EcoP1 ， EcoP15 识别位点：AGACC，CAGCAG 切割位点：下游24-26bp处,1.1.3 限制性内切酶识别的序列,识别长度 识别结构 切割位点,识别长度,4：Sau3AI GATC 5：EcoRII CCWGG W=A or T NciI CCSGG S=C or G 6：EcoRI G
6、AATTC HindIII AAGCTT 7：BbvCI CCTCAGC PpuMI RGGWCCY 8：Not I GCGGCCGC,回文对称(palindrome) EcoRI GAATTC CTTAAG HindIII AAGCTT TTCGAA,识别结构,非回文对称(non-symmetria) AccBSI CCGCTC GGCGAG BssSI CTCGTG GAGCAC 多识别序列 (degenerate sequence) AccI GTMKAC HindII GTYRAC,间断对称(interrupted symmetria) AlwNI CAGNNNCTG DdeI CTN
7、AG,简并碱基代表字母,R=A or G Y=C or T M=A or C K=G or T S=C or G W=A or T H=A or C or T B=C or G or T V=A or C or G D=A or G or T N=A or C or G or T,切割位置,内部 两端 EcoRII CCWGG GGWCC Sau3AI GATC CTAG NlaIII CATG GTAC,两侧 10(N)CGA(N)6TGC(N)12 12(N)GCT(N)6ACG(N)10 NNCASTGNN NNGTSACNN,TspRI,BcgI,切割概率 4Nt=44=256 6Nt
8、=46=4096 即当识别序列(recognition sequence)为4个或6个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每256个和4096个碱基会出现一个识别序列。,1.1.4 限制性内切酶产生的末端,粘性末端 (cohesive ends) 5突出末端 EcoRI GAATTC CTTAAG NNG AATTCNN NNCTTAA GNN 3突出末端 KpnI GGTACC CCATGG,平端(Blunt end) 在对称轴上同时切割DNA的两条链 HaeIII GGCC EcoRV GATATC XmnI GAANNNNTTC 非对称突出端 非对称识别序列 BbvCI CC
9、TCAGC GGAGTCG 简并序列 间隔序列 DraIII CACNNNGTG,同裂酶(isoschizomer) 识别相同序列的限制酶称同裂酶 同序同切(同功酶) HindII HincII GTY/RAC HpaII HapII C/CGG MobI Sau3AI /GATC 同序异切 KpnI GGTAC/C Acc65I G/GTACC Asp718I G/GTACC 同尾酶(Isocaudiners) 平端 (blunt end) 部分同裂酶 (isoschizomer),EcoRI GAATTC MfeI CAATTG ApoI RAATTY SpeI ACTAGT NheI G
10、CTAGC XbaI TCTAGA,BamHI GGATCC Sau3AI GATC,1.1.5 末端长度对切割的影响,因此，在双酶切多克隆位点(multiple cloning site)时，选择合适的酶切秩序； 在设计PCR引物引入酶切位点时，应在位点之外引入所要求的碱基数，一般在末端另加4个； 具体参照NEB操作手册。,1.1.6位点偏爱 (site preference),某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割(preference incistion)； 1975，EcoRI切割 phage (Lambda)中的5个位点，并不是随机的，靠近右端的位点，比分子中间的位点切割快
11、10倍； 1976，EcoRI在腺病毒2 (adenovirus-2) DNA 中的切割速率不同。,1.1.7 酶切反应条件,pH：7.0-7.9 (at 25)，Tris-HCl，乙酸； 离子强度： NaCl，高（100mM）、中（50mM）、低（）； Mg2+ ：10mM MgCl2 or MgAc； DTT (dithiothreitol，二硫苏糖醇) ：1mM； 100g/ml BSA，少数需要。,每一种酶都有其最适的反应条件，请参考产品说明书！,双酶切策略,选用都合适的缓冲液或通用缓冲液； 当缓冲液不可替代时：先低盐缓冲液再高盐缓冲液（DNA可纯化或不纯化）,注意事项,取少量酶 最后
12、加酶、尽快操作 减少反应体积 延长反应时间 分装保存,反应温度,大多数为37 一部分为50-65 少数25-30 反应终止 EDTA 终浓度10mM 加热 65 （80）20min,1.1.8星星活性(star activity),在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性(star activity)； 实际上星星活性(star activity)是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。,引起星星活性的因素,高甘油(glycerin)浓度（5%） 酶过量（100U/l） 低离子强度（8.0) 有机溶剂：PMSD(二甲
13、基亚砜)、乙醇(ethanol)、乙二醇(glycol)、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺dimethylformamide）和sulphalane等 用其它二价阳离子如Mn+、Cu+ 、Co+或Zn+代替Mg+,星星活性的抑制,减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度 保证反应体系中无有机溶剂或乙醇 提高离子强度到100150mM(在不抑制酶活性的前提下) 降低反应pH至7.0 使用Mg2+作为二价阳离子,1.1.9单链DNA的切割,HinP1I, HhaI, MnlI，50 HaeIII，10% BstNI, DdeI, HgaI, HinfI, TaqI，
14、1 AluI, BbvI, DpnI, FnuDII, FokI, HpaII, HphI, MobI, MobII, MspI, Sau3AI, SfaNI，不切割,1.1.10 影响酶活性的因素,“外因” 底物的纯度 “内因” site preference 甲基化(methylation) 底物的构象: 切割cccDNA和linear DNA时表现的差异，与切割DNA相比，EcoRI、PstI、SalI 需要至少5倍的酶来切割pBR322的I型DNA。,1.1.11 酶切位点在基因组中分布的不均一性,基因组中，碱基对的排列是非均匀的，因此尽管GC含量相同的酶切位点，在基因组中出现的机率是
15、不一样的。 在E.coli中,酶切位点出现的平均长度 AscI(GGCGCGCC) 20kb NotI(GCGGCCGC) 200kb EcoRI/HindIII 5kb SpeI(ACTAGT) 60kb,细菌基因组(bacteria genome) 在大多数富含A+T的细菌中，CCG和CGG的排列是最少见的，所以含有这两种序列的识别序列出现的机率就非常少； 酵母基因组(yeast genome) G+C%为38%，因此富含G+C的识别序列特别少； 哺乳动物 G+C为41%，其中CG的序列比想象的低5倍之多，因此含CG序列的酶切位点在哺乳动物细胞相当稀少。而且在哺乳动物细胞中，大多数CG序列
16、是甲基化的。,1.2 甲基化酶（Methylase）,真核生物(eukaryote)和原核生物(prokaryote)中存在大量的甲基化酶； 原核生物的甲基化酶作为修饰系统，保护自身的DNA不被相应的限制酶切割； 大肠杆菌有三种甲基化酶 Dam甲基化酶 Dcm甲基化酶 EcoK I甲基化酶,Dam甲基化酶,识别GATC，在腺嘌呤N6位置引入甲基(methyl)； PvuII、BamHI、BclI、BglII、XhoII、MboI、Sau3AI的识别位点中含GATC序列； ClaI(1/4)、XbaI (1/16)、TaqI (1/16)、MboII (1/16)、HphI(1/16)的部分识别
17、序列含GATC序列，4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列； BclI、ClaI、MboI和XbaI受甲基化影响； BamHI、Sau3AI、BglII和PvuI等不受甲基化影响； 一般哺乳动物DNA，不会在A-N6上甲基化。,Dcm甲基化酶,识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个C上C5位置上引入甲基； EcoRII /BstNI，CCA(T)GG，二者识别序列相同，但切点不同，EcoRII受dcm甲基化作用影响，BstNI可避免这一影响； 受影响的酶： Acc65I、AlwNI、ApaI、EcoRII、 EaeI 不受影响的酶： KpnI、BanII、Bg1I、BstNI、Na
18、rI,EcoKI甲基化酶,识别AAC(N)6GTGC, 在N6位置甲基化 TTG(N)6CACG 识别位点少(1/8kb) 研究较少，而dam（1/256bp） dcm(1/512bp),SssI甲基化酶,来自原核生物螺原体（Spiroplasma），可在CG序列中的C在C5位置上甲基化，又称CG甲基化酶； 许多酶对此甲基化敏感，如AatII、ClaI、XhoI、SalI等； 不敏感的有BamHI、EcoRI、SphI和KpnI。,甲基化对限制酶切的影响,修饰酶切位点 TCGA中的A甲基化后，GTCGAC将不受HincII切割； 构建DNA文库(DNA library)时，用AluI(AGCT
19、)和Hae(GGCC)部分消化基因组DNA，用甲基化酶处理，然后加上合成的EcoRI接头，当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割。 产生新的酶切位点 TCGATCGA AGCTAGCT TaqI TaqI TCGA*TCGA* *AGCT*AGCT DpnI,1.3 DNA聚合酶,真核DNA polymerase DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 原核DNA polymerase I：一条多肽链，可催化单链或双链DNA的延长； II：一条多肽链，与低分子脱氧核苷酸链的延长有关； III：多聚酶，是促进DNA链延长的主要酶。,E.coli
20、DNA polymerase I,53DNA聚合酶活性,Mg2+ 、dNTP DNApolyI,53外切核酸酶活性,Mg2+ DNApolyI,+ dNTP,降解RNA:DNA中的RNA(RNase H 活性),35外切酶活性,Mg2+ DNApolyI,+ dNTP,DNA polymerase I的用途,切口平移法(nick translation )标记DNA,Mg2+，低限量DNase I,dNTP，DNA poly I,若有放射性dNTP，则可标记成探针(probe),用于cDNA克隆中的第二链 即单纯的DNA聚合活性，但由于有5-3外切活性，已不再使用，而改用Klenow酶和反转录
21、酶(reverse transcriptase ) 末端标记（end labeling）（ 交换或置换反应）,Mg2+, DNApoly I -P32dATP,A* T,T4 DNA poly T7 DNA poly 更好,Klenow酶,DNA polymerase I经蛋白酶（proteinase)（枯草杆菌蛋白酶）裂解, 从全酶中除去53外切活性片段，而聚合活性和35外切活性不受影响，大小为76kDa ； 通过基因工程也可以构建得到； 作用与DNA polymerase I相似。,T4 DNA polymerase,来源于T4 phage感染的E.coli， 114kDa； 与Kleno
22、w酶相似，但3- 5外切活性强200倍; 用途 补平或标记3 凹端，必须有高浓度dNTP（末端标记） 置换反应：必须有高浓度dNTP(一种)末端标记,T7噬菌体DNA聚合酶,来源于T7 phage感染的E.coli,为两种紧密结合的蛋白质复合体（噬菌体基因5蛋白和宿主的硫氧还蛋白）； 与Klenow酶相似，但3- 5外切活性强1000倍; T7 DNApoly为持续合成能力最强的一个，产物平均长度要大得多，在测序时具有优势。 用途: 替代T4 DNApoly的功能 长模板的引物延伸(primer extension),反转录酶,依赖于RNA的DNA聚合酶， 53合成DNA，无35外切活性； 来
23、自禽成髓细胞瘤病毒（ AMV ），鼠白血病病毒（Mo-MLV）； AMV 二链多肽(62kDa/94kDa)，同时具很强的RNase H活性。因此，在反应开始时，引物(primer)和mRNA模板(template)杂交体可成为RNase H的底物，此时，模板的降解和cDNA的合成相竞争； Mo-MLV 单肽，84kDa，RNase H 活性弱，利于合成较长的cDNA。,末端转移酶,来源于小牛胸腺，存在于前淋巴细胞(prolymphocyte)及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA聚合酶； 在二价阳离子存在下，末端转移酶(terminal transferase )催化dNTP加于DN
24、A分子的3羟基端； T or C 首选 Co2+ A or G首选Mg2+,底物 DNA，可短至3个核苷酸，3突出 低离子强度时，5突出或平端DNA亦可，但效率低 用途 在3端加同聚尾，cDNA或载体(vector)，用于克隆(clone)或标记(label) 末端标记 ddNTP,同聚尾的长度,37 15min 随时间的延长尾亦长。,1.4 其他分子克隆工具酶,RNA聚合酶 来源于噬菌体(phage)感染宿主后所产生 SP6噬菌体RNA聚合酶，来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株； T4或T7噬菌体RNA聚合酶，来源于感染的大肠杆菌（E.coli）。 活性 这些RNA聚合酶实际上为转录过程中R
25、NA合成的酶，识别DNA中特异的启动子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。与DNA聚合酶不同，无需引物(primer)，但识别特异性位点。,RNA聚合酶的用途,体外(in vitro) 将这些RNA聚合酶特异性的启动子安装在载体中，如pGEM-3Z载体(2.74kb、p13)中，用于体外转录外源DNA； 体内(in vivo) 将T7 RNA 聚合酶基因置于 lacUV5 启动子之下，插入到噬菌体DE3中，感染E.coli，整合于染色体的BL21处。将T7噬菌体启动子控制的目的基因 经质粒导入该宿主菌中，在IPTG诱导下，启动外源基因的表达。,连接酶(Ligase),T4 DNA li
26、gase 68kDa，T4噬菌体感染大肠杆菌产生 催化DNA 5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键 底物： DNA or RNA(效率低) 粘端(matched end)、切口(nick)、平端(blunt end) 10% PEG(聚乙二醇)，单价阳离子（150-200mM NaCl）提高平端连接速率。 条件 164hr；4overnight ， 需ATP,E.coli DNA ligase 与T4 DNA ligase相似，但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 参与； 平端连接效率低，不将RNA连接到DNA，不连接RNA。 Taq DNA ligase 连接dsDNA中的缺口 作用于456
27、5，需NAD+ T4 RNA ligase 催化ss DNA或 RNA的 5-磷酸与 3羟基之间形成共价连接,核酸酶 ( nuclease),BAL 31 核酸酶 来源于Alteromonas espejiana BAL31 主要活性为3外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3端去除单核苷酸；具有内切核酸酶活性，切除单链DNA; 依赖 Ca2+，EDTA可抑制其活性 用途：从两头缩短DNA (用于缺失突变等）,Sl核酸酶,来源于米曲霉(Aspergillus oryzae) 降解单链DNA或RNA 对dsDNA，dsRNA，DNA:RNA不敏感 酶量大可完全消化双链，中等酶量可在切口(nick
28、)或小缺口(gap)处切割双链 用途： 去掉突出的单链尾，以产生平端 打开dsDNA合成中产生的发荚环,绿豆核酸酶,来源于绿豆芽 与Sl nuclease 相似，但比Sl更温和,核糖核酸酶A,来源于牛胰，内切核酸酶； 可特异攻击RNA上嘧啶残基的3端； 用途： 除去DNA样品中的RNA 除去DNA:RNA中未杂交的RNA区,DNase I,来源于牛胰，内切酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解 ds or ss DNA； Mg2+：独立作用于每条DNA链，切割位点随机； Mn2+：两条链的大致同一位置切割dsDNA，产生平端 或1-2个核苷酸突出； 用途： 切口平移(nick translation
29、)标记，在dsDNA上随机产生切口 随机克隆，以便安插在M13 phage上测序 分析 蛋白:DNA复合物（DNA酶足迹法） 除去RNA样品中的DNA（RNase-free）,RNase H,内切核酸酶，特异性水解与DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，产生3-OH和5P末端的产物； 不降解单链核酸、dsDNA or dsRNA； 许多酶附带该活性，比如AMV反转录酶； 用途： 在cDNA克隆，合成第二键之前去除RNA。,RNase One,Promega开发，基因工程酶， 27kDa，可以将RNA降解至单核苷酸，可以在任意碱基处内切磷酸二酯键。,T4多核苷酸激酶,催化ATP的 -磷酸基转移至DNA或 RNA的 5末端，也具有3磷酸酶活性； 高浓度ATP发挥最佳活性。NH4+强烈抑制剂； 用途： 用于对缺乏 5-磷酸的 DNA进行磷酸化(phosphorylation)。以致可用于DNA连接； 交换反应：过量的ATP可使该激酶将磷酸化的5端磷酸转移给ADP，然后DNA从-32pATP中获得放射性标记的-磷酸而重新磷酸化。,碱性磷酸酶,种类： 牛小肠碱性磷酸酶（CIP，CIAP） 细菌碱性磷酸酶（BAP） 活性： 除去DNA or RNA 5磷酸 用途： 防止DNA片段自身环化 标记前（5端）除5磷酸,