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1、牛乳中乳脂、酪蛋白和乳糖的分离鉴定2010年第11期(总第135期)大众科技DAZHONGKEJNo.11.2010(CumulativelyNo.135)牛乳中乳脂,酪蛋白和乳糖的分离鉴定武莹浣2(1.武汉软件工程职业学院,湖北武汉430205;2.武汉广播电视大学,湖北武汉430205)【摘要】牛乳中乳脂,酪蛋白和乳糖的分离鉴定作为高职高专食品生物化学教学的综合实训项目,涵盖方法技术多样,培养学生各项技能.这个系列实训项目包括:用有机溶剂二氯甲烷萃取牛乳中乳脂并蒸馏分离.脱乳脂的牛乳的用等电点沉淀分离得酪蛋白,以醋酸纤维薄膜电泳鉴定,双缩脲法测定其纯度.分离酪蛋白后所得乳清液,通过加入乙醇
2、,浓缩,结晶制取乳糖,生成糖脎,观察糖脎结晶形状证实乳糖的存在.【关键词】乳脂;酪蛋白;乳糖;分离;鉴定【中图分类号】TS252.1【文献标识码】A【文章编号】10081151(2010)1卜010502牛乳中含有丰富的蛋白质,脂肪,碳水化合物,矿物质及维生素,成分齐全,容易消化,风味香甜,倍受人们的青睐.牛乳中乳脂,酪蛋白和乳糖的分离鉴定可作为高职高专食品生物化学教学中代表性的综合实训项目,涵盖了萃取,沉淀和蒸馏分离法,分光光度法,电泳和重结晶等多项技术内容,可深化对理论知识理解,培养各项操作技能,经多年实践效果显着,其主要实训内容介绍如下.(一)牛乳中的乳脂1.乳脂的分离牛乳中的脂肪主要是
3、乳脂,属三磷酸甘油脂类.多数由C4C6饱和脂肪酸生成,全乳中约含4%脂肪,乳脂以直径为0.110um很小的脂肪球分散于水中,因此乳中的脂肪更易消化.乳脂易溶于二氯甲烷和石油醚,因此可用二氯甲烷或石油醚萃取,蒸馏分离,测定其含量.称取全脂奶粉2O克,加入100毫升的二氯甲烷,在不断的搅捧下加热至沸23分钟,趁热真空抽滤,将过滤的沉淀物自然干燥,备用于酪蛋白和乳糖的分离:滤液则倒入已烘干至恒重,并记录重量的蒸馏烧瓶中,加热至约4O,蒸馏回收二氯甲烷,此时电热套电压设定100伏,速度不要过快,至二氯甲烷完全蒸完,冷却,洗净瓶的外壁,放入105的烘箱烘干恒重,称量,计算乳脂的得率.2.讨论(1)二氯甲
4、烷是不可燃低沸点溶剂,常用来代替易燃的石油醚和乙醚等,但易挥发,蒸馏时注意密闭和尾气吸收.也可用石油醚来做此实验.(2)加热时要不断的搅拌,使二氯甲烷充分接触到奶粉,提高乳脂产率.蒸馏回收的二氯甲烷可循环使用,蒸馏时速度不宜过快,以免把乳脂带出,影响产率.(二)牛乳中的酪蛋白1.酪蛋白的分离牛乳中的蛋白质主要是酪蛋白,以酪蛋白酸钙一磷酸钙复合体胶粒存在.蛋白质是两性化合物,利用加酸,达到酪蛋白等电点pH为4.64.8左右,胶束外的负电荷被中和,中性酪蛋白溶解度最小,沉淀析出.用乙醇,乙醚和石油醚将其中残余的脂类物质洗涤除去.蒸馏水洗涤除去可水溶性杂质如乳清蛋白,乳糖及残留的缓冲溶液.在脱去乳脂
5、的奶粉中,加入50毫升水,搅拌使其溶解,加热至4O,慢慢滴加10%乙酸溶液,上层有沉淀产生,慢慢将沉淀压至烧杯底部,再继续滴加,不断用pH试纸测试pH值在4.64.8之间,直至沉淀完全.静置冷却,倾去上层乳清液备用,剩余悬浮液离心分离lO分钟(2000转/分),倾出上层清液(合并于以上乳清液中),在乳清液中迅速加入4克碳酸钠粉末,搅拌留作分离乳糖用.用蒸馏水洗沉淀二次,搅拌,离心后弃去上层液.向酪蛋白粗产品中加人6O毫升95%乙酸,搅拌后至铺有200目的尼龙布的布氏漏斗抽滤,用乙醇和乙醚等体积混合液30ml洗涤两次,30毫升乙醚分两次洗涤.最后真空过滤得白色的酪蛋白,移至表面皿中,自然干燥,称
6、重.(或用石油醚进一步脱脂,将酪蛋白用滤纸包裹,放入石油醚中大约1小时后取出,打开滤纸让石油醚完全挥发),计算酪蛋白的含量.2.酪蛋白醋酸纤维薄膜电泳采用电泳方法鉴定酪蛋白是分离生物大分子常用的手段.利用酪白质颗粒的等电点大部分低于7,在pH8.6的缓冲液中带负电荷,在电场中向正极移动,电泳后根据酪蛋白移动快慢,染色后显出清晰三个色带.称取以上分离的酪蛋白0.5克,溶解于含0.4mol/L氢氧化钠的5毫升生理盐水中.将2厘米8厘米的醋酸纤维薄膜浸于巴比妥缓冲液(pH8.6,离子强度0.07)中,20分钟后取出,用滤纸吸干多余缓冲液.用点样器蘸上酪蛋白溶液,于膜膜麻面(距膜边端1.5厘米处)点样
7、,使其全部渗入膜内,点样面向下,两端拉紧贴于电泳槽架的滤纸桥上,点样端在阴极,进行电泳,电压为120伏,线电流约为0.4O.6mA/cm,时间约4060分钟.电泳结束后,取出薄膜浸入染色液(0.5克CoomassieaR250溶于1升,乙酸:甲醇:dH2o=1:5:5的溶液).染色5分钟后取出薄膜,立即浸入漂洗液(甲醇:乙酸:dH0=1:1.5:17.5)中进行漂洗,34次至无背景,可见三条酪蛋白谱带.3.酪蛋白测定用双缩脲法测定酪蛋白的纯度,蛋白质含有两个以上的肽键,有双缩脲反应.在碱性溶液中蛋白质cu形成紫红色络合物,其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关.在
8、一定的实验条件下,未知样品【收稿日期】20100731【作者简介】武莹浣(1963一),武汉软件工程职业学院副教授,武汉广播电视大学环境与生化工程系副教授,研究方向为食品生物化学.一lO5一溶液与标准酪蛋白溶液同时反应,并于54Onto下比色,通过标准酪蛋白的标准曲线求出未知样品的酪蛋白浓度.绘制标准曲线:取一系列比色管,分别加入0,0.4,0.8,i.2,i.6,2.0毫升的5mg/mL标准酪蛋白溶液(用0.05moL/L氢氧化钠配制).用水补足到2毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂.在室温下放置30分钟,在540nm波长下用分光光度计比色测定吸光度.以吸光度为纵坐标,酪蛋白的含量为横坐标绘制标
9、准曲线,作为定量的依据.酪蛋白纯度的测定:称取以上分离的酪蛋白0.25克,溶解于含0.05moL/L氢氧化钠溶液中,水浴加热,用50毫升容量瓶定容,酪蛋白配制浓度约为5mg/mL.吸取1毫升稀释的酪蛋白待测液,用水补足到2毫升,操作同前,平行做两份.与标准曲线的各管同时比色,测定其吸光度.由标准曲线上查出纯酪蛋白浓度,再按照稀释倍数求出计算从牛乳中分离出来的酪蛋白的纯度.4.讨论(1)分离酪蛋白时,加醋酸时,需边搅拌,边测pH,同时观察沉淀.搅拌开始可稍快,接近等电点时,应慢慢搅拌.酪蛋白沉淀用200目的尼龙布抽滤过比较好,用滤纸过滤很慢;而用纱布过滤酪蛋白易粘在其上.(2)纯净的酪蛋白为白色
10、,若发黄表明脂肪未洗净.用乙醇和乙醚清洗酪沉淀时,应搅拌,浸泡,充分洗净脂肪.若洗涤不净,可进一步用石油醚,将烘干酪蛋白中的脂类除去,大大提高酪蛋白的纯度.(3)用双缩脲法测定酪蛋白纯度时,应使酪蛋白与双缩脲试剂反应完全,否则测量结果会有误差.(三)牛乳中的乳糖1.乳糖的分离牛奶中的糖主要是乳糖,它是唯一由哺乳动物合成的糖.脱脂乳中除去酪蛋白后剩下的乳清液中含有乳白蛋白和乳球蛋白,还有溶解状态的乳糖,在乳清液中加碳酸钠既可以中和溶液的酸性,防止加热时乳糖水解,又能使乳白蛋白沉淀.乳糖不溶于乙醇,将乙醇加入乳清液中,乳糖会结晶出来,可通过浓缩,结晶制取乳糖,从而达到分离的目的.把上述除去酪蛋白后
11、加入碳酸钠的乳清液加热煮沸23分钟,并不断搅拌,然后真空抽滤除去沉淀,将滤液加热浓缩至原体积的一半,加入150毫升95%乙醇和少量活性炭,搅拌均匀后水浴加热至沸,趁热过滤,滤液倒入烧杯中冷却,(上接第96页)后,还会带来另外一些负面影响.一方面,细格栅渠道宽度会增加,增加土建投资.另一方面,细格栅水头损失会增加,细格栅运行荷载增加.同时,单台细格栅通水量减少,运行时间增加,对设备的材质和可靠性提出了进一步的要求.上海白龙港水质净化厂的管理人员,在细格栅的实际改造过程中,就把起初的lOm栅条间隙,中间改为6mm,最终定为8mm.这很大因素上取决于当时国产设备的制造能力的实情.实际上,在不改变通过
12、栅条间隙的情况下,选择合适类型的细格栅同样也可以提高细格栅的运行效果.在乌鲁木齐市河东污水处理厂,原细格栅栅隙lOmm,大量的瓜籽壳,木片,塑料袋等垃圾还是通过了格栅间,在中间沉淀池浮起,形成一层厚厚的浮渣,几乎看不到液面.后来将细格栅更换为靶齿链回转式除污机,格栅栅隙未变,浮渣问题好转.这说明,栅条间隙无需盲目缩小.(三)结论1.在南方的雨污合流制系统中的预处理设备,不宜采用雨季备用,旱季检修的原则.南方城镇污水处理厂中的预处.106.加塞放置过夜,静置待乳糖结晶析出(或用冰浴中冷却,用玻棒搅拌摩擦,使乳糖析出完全),用细孔度滤纸过滤,95%乙醇洗涤,得粗乳糖晶体.再将粗乳糖晶体溶于2O毫升
13、6O水中,滴加乙醇至产生浑浊,水浴加热至浑浊消失,冷却,过滤,用95%乙醇洗涤晶体,干燥后得含一分子结晶水的纯乳糖,称重,计算牛乳中乳糖的含量.2.乳糖的性质及鉴定糖中的羰基能与苯肼作用生成苯腙,但是当苯肼过量时,可进一步作用生成糖脎.糖脎是黄色晶体,不同糖脎的结晶形状不同,可以鉴别不同的糖.(1)乳糖水解:取0.5克自制的乳糖置于大试管中,加入5毫升蒸馏水使其溶解,取出1毫升乳糖溶液置于另一试管中,备用作糖脎鉴定.在余下的4毫升乳糖溶液中加入2滴浓硫酸,于沸水浴中加热l5分钟,冷却后,加入10%碳酸钠溶液使呈碱性.(2)糖脎的生成:在l毫升上述乳糖水解液中及备用的l毫升乳糖溶液中,分别加入新
14、鲜配制的盐酸苯肼一醋酸溶液l毫升摇匀,试管口用棉花塞住,置沸水浴中加热,并不时振摇,加热2030分钟后,取出放置冷却,糖脎成结晶析出.取少许结晶在显微镜下观察三种糖脎结晶形状,可证实为乳糖.3.讨论(I)乳糖分离时,必须在短时间内完成,否则乳糖会被细菌水解成半乳糖,乳糖过滤后在乙醇中滤液应是澄清的,否则乳糖很难结晶.如果过滤后的溶液不澄清,可以加1克活性炭脱色后过滤.(2)乳糖水解生成一分子半乳糖和一分子葡萄糖,当形成糖脎后可通过显微镜看到不同形状的美丽结晶,同时采用纯乳糖,半乳糖和葡萄糖的糖脎作对照效果很好.(3)苯阱试剂有毒,小心使用,勿触及皮肤,如触及皮肤先用稀醋酸洗,再用水洗.【参考文
15、献】1】王秀奇,秦淑媛,等.基础生物化学实验【M】.高等教育出版社.1999.【2】李如亮.牛物化学实验j.武汉:武汉大学出版社,1998.【3潘宁.食品生物化学M】.化学工业出版社,2006.理国产设备应专设故障备用.2.细格栅的栅条间隙设计,应从具体水质分析.南方城镇污水处理厂的细格栅栅条间隙可定为56mm.【参考文献】【1】Metcalf&Eddy,Inc.wastewaterEngineeringTreatmentandReuse.2002.2】高颖(德国汉斯琥珀公司).碳源回收和栅渣处理技术】.中国建设信息(水工业市场),2009.【3】裴海燕,胡文容,等.活性污泥与消化污泥的脱水特性及粒径分布】.环境科学,2007,VOL28(1O).【4】李军,周延年,等.城镇污水处理厂好氧颗粒污泥的特性】.应用与环境生物,2008,VOL14(5).【5】BeunJJ,vanLoosdrechtMCM,HeijnenJJ.Aerobicgranulationinasequencingbatchairliftreactor】.WaterResearch,2002,V0L36:702712.66姚俊芹,等.乌鲁木齐市河东污水处理厂AB工艺介绍【】.给水排水,VOL32(3)2006.