《基因工程菌发酵过程中的不稳定性研究.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程菌发酵过程中的不稳定性研究.doc（15页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、基因工程菌发酵过程中的不稳定性研究 深 圳 职 业 技 术 学 院 学 报 2002年第 3期 Journal of Shenzhen Polytechnic No.3, 2002基因工程菌发酵过程中的不稳定性研究黄志立 (深圳职业技术学院 生物应用工程系,广东深圳 518055)摘 要: 从基因工程菌(细胞)的生长动力学模型入手,阐述了导致基因工程菌不稳定的 原因及不稳定性的表现;探讨了防止或降低基因工程菌不稳定性的对策,包括组建合适载体、 选择适当宿主、施加选择压力、控制基因过量表达及控制培养条件等。 关键词:基因工程菌;不稳定性;影响因素 中图分类号:Q784/Q785文献标识码: A
2、文章编号: 1672-0318200203-0023-06 基因工程是在生物体外对 DNA 分子进行重组结合,然后克隆到适合的宿主细胞,进行增殖和表达的遗传操作,所得重组体菌株即是工程菌。1972年,Berg 等人成功地把病毒SV40 与大肠杆菌的l噬菌体 DNA 实现了重组。第 2 年,Cohen 把外源基因克隆到大肠杆1菌内并实现了表达,在世界上首次生产出基因工程产物 。目前基因工程已发展为当代生物技术的核心,是国际生物工程最热门的研究领域之一。随着基因重组技术的进展,基因工程菌株的培养技术也越来越受到重视。目前基因工程所采用的宿主细胞原核的有大肠杆2菌和枯草杆菌,真核细胞有酵母和哺乳动物
3、细胞等,生产上多以大肠杆菌为主 。 采用基因重组技术构建的基因工程菌或细胞,由于含有带外源基因的重组载体,因而对其进行培养与发酵的工艺技术与通常采用单纯的微生物细胞的工艺技术有许多不同之处,基因工程菌(细胞)培养与发酵的目的是希望其外源基因能够高水平表达,以便获得大量的外源基因产物。而外源目的基因的高水平表达,不仅涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的相互关系,而且与其所处的环境条件密切相关。研究发现,工程菌在保存及发酵生产过程中表现出不稳定性,该问题的解决已成为基因工程的高技术成果能否转变为生产3力的关键因素之一 。 1 基因工程菌(细胞)的不稳定性 1.1 基因工程菌(细胞)的生长动力学模型
4、4以对数生长期为例,处于该时期的微生物生长的数学模型如下 : dX / dt mX (1) 其中:X 为细胞数量;t为培养时间; m 为比生长速率。 + -假设在一定时间内含质粒细胞( X )丢失质粒变为缺质粒细胞( X )的机率为 p, 收稿日期:2002-07-09 作者简介:黄志立(1974-),女,四川兴文人,博士,主要从事微生物学及分子生物学领域的研究工作。23 + - + + -N个 X 将会产生 N?p 个 X 和 N?(1-p)个 X ,则 X 与 X 细胞指数生长的表达式5为 : + + + dX / dt 1- pm X (2) - + + - - dX / dt pm X
5、 +m X(3) +式(2)和(3)成立的前提是假设细胞的质量与细胞的数量大致成正比。如果已知 X ? + ?和 X 的初始浓度,就可以通过对式(2)和(3)进行积分,求出某一时刻 X 与 X 的浓度。+将总细胞数中 X 所占比例定义为 f ,它可以表示为: + + - f X /X + X (4) 4在对数生长期,世代数 n可由下式求出 : +n m t / ln 2 (5) 根据式4和5可以得出生长到第 n 代时的 f 值: 1-a - p fn (6) na+ p-11-a - p2 - +此处a为缺质粒细胞比生长速率与含质粒细胞比生长速率的比值,即a m /m 。式6可用以推算在间歇发
6、酵中 f 值随世代数 n的变化情况,这在基因工程菌株的发酵中是非常重要的参数,例如,假设从斜面培养到 33 000 L发酵培养需要 25 代时间,25代后含质粒细胞还占多少,即 f 为多少就是一个必需考虑到的问题。分析结果表明 f 值随255p和a 的增大而减小 。 1.2 基因工程菌(细胞)不稳定性的表现 基因工程菌的不稳定包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定 2 个方面。具体表现为下列 3种形式:质粒的丢失;重组质粒发生 DNA 片段脱落;表达产物不稳定。 由于某种环境因素或生理、遗传学上的原因,质粒从某些宿主细胞中丢失,因此工程菌的发酵过程实际上是 2种菌的混合。在非选择性条件下,含有重
7、组质粒的工程菌的比生长速率往往小于不含重组质粒的比生长速率,即a1。在这种情况下,或者当质粒丢失率 p比较大时,对工程菌的发酵都极为不利。 有时质粒不稳定并非由于质粒丢失,而是重组质粒上一部分片段脱落,表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。据报道将 E.coli 的载体 pBR322与 B.subtilis 中的质粒 pUB110 重组一种可在这 2 种宿主中都能复制的穿梭型载体时,发现新组建的穿梭质粒6在传代中出现不稳定性,研究结果证明丢失的是 pBU110原有结构 。 除上述现象外,产物不稳定也是一个很重要的问题。例如,某些人干扰素工程菌在表达干扰素时,随着培养时间的延长,干扰素活
8、性反而下降。在其它工程菌培养过程中也有24 6类似现象发生,说明基因表达形成的产物也存在稳定性的问题 。 1.3 引起工程菌不稳定性的因素 重组质粒引入宿主后,引起宿主细胞和重组质粒之间的相互作用,在一定的环境中,其结果是在重组质粒上表达或不表达,重组质粒遗传稳定或不稳定。因此一个组建成的工程菌的稳定与否,取决于重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件 3个方面。 就质粒本身的分子结构而言,引起工程菌不稳定常常是由于稳定区受到影响。某些质粒如 pSC101,R1,F等的分配系统在质粒上的位置已确定,质粒 col DF13有 2 个 DNA 序列对它的稳定起着不可缺少的作用。枯草杆
9、菌质粒 pUB110 上有几个与膜结合的蛋白基因与稳定性有关,如果质粒在重组过程中影响到这些序列的完整性,其稳定性也受到影响。另外可能由于重组质粒上有重复序列,或与宿主染色体有部分同源等都会造成质粒的不稳定。就宿主而言,除了上述质粒中有同源序列外,还与宿主的比生长速率、宿主中重组基因的完整性、重组时有关基因的具体变异等有关系。在培养环境中高温(如 42以上) 、7去垢剂、某些药物、紫外线辐射等也会引起质粒的丢失 。 2 防止或降低基因工程菌(细胞)不稳定性的对策 2.1 组建合适载体 常用质粒 pBR322,pUB110在相应宿主中很稳定,而二者组成穿梭质粒或与外源片段进行重组后,常出现不稳定
10、现象。如 pC194是 B.subtilis中的一个常用质粒,亦较稳定,但在其 Hind切口处插入一段 DNA,形成的重组质粒稳定性就降低了。在无选择压力的情况下,经 20 世代后,含 pC194 的菌体占总菌体的 99.5%以上,而重组质粒的丢失率为10%80%,这是由于插入外源 DNA 后破坏了该质粒的稳定区。而在离 Hind较远处,即3使去换 600个碱基,新形成的质粒的稳定性并未受到影响 。 2.2 选择适当宿主 重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗传特性的影响。相对而言,重组质粒在大肠杆菌中比较稳定,而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。在选择宿主时,必须确定其遗传特点,这直接关系到组建
11、成工程菌的稳定性。正常质粒 pUB110 与重组质粒 pKTH10 在 3种不同宿主中培养 50 世代后的稳定性的比较结果反映了它们的差异(表 1) 。对 pUB1108而言,在 3种宿主中都很稳定,而淀粉酶基因克隆菌 pKTH10则有明显差异 。 表 1 不同宿主对质粒稳定性的影响质 粒 宿 主 检查菌落数(个) 50 代后的丢失率(%) B.S.168 2024 0.05 3 s pUB110 B.S.168amR pap 1252 0.08 B.S.168 SacU 9 1059 0.09 B.S.168 3821 0.03 3 s pKTH 10 B.S.168amR pap 2803
12、 0.71 B.S.168 SacU 9 1539 99.925 2.3 施加选择压力 从遗传学角度,施加选择压力即是选择某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。在重组 DNA 技术中,选择压力应用很多,如转化后用选择压力确定含有重组质粒的克隆株;在利用克隆菌进行发酵生产时,采取施加选择压力来消除重组质粒的分配性不稳定,以提高菌体纯度和发酵产率。施加选择压力的方法主要有: 1)抗生素添加法。将含有抗药性基因的重组质粒转入不耐药的宿主细胞后,克隆菌也获得了抗药性。在克隆菌发酵时,培养基中加入适量的相应抗生素,就可阻止丢失了重组质粒的非生产菌的生长。但这种方法不适用于大规模生产。
13、且对相对简单的培养基,加入大量的抗生素会增加生产成本。对于易被酶水解失活的抗生素,添加抗生素造成的选择压9力只能维持一定时间 。 2)抗生素依赖变异法。通过诱变使宿主细胞成为某抗生素的依赖性突变株,即只有在该抗生素存在时宿主细胞才能生长,而重组质粒上含有该抗生素的非依赖性基因,将重组质粒导入宿主细胞后,所得的克隆菌就能在不含抗生素的培养基中生长。因此在进行发酵生产时,不需要向培养基中加入抗生素就能达到消除重组质粒分配性不稳定的目的。这种9方法可以节省大量抗生素,具有实用价值,它的缺点是宿主细胞容易发生回复突变 。 3)营养缺陷型法。营养缺陷型稳定性方法的原理是通过诱变使宿主细胞染色体缺失生长所
14、必需的某一基因,将该基因插入到重组质粒中,然后选择适当组成的培养基使失去重9组质粒的细胞不能存活,只有含重组质粒的细胞才能生长 。 2.4 控制基因过量表达 提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率。但研究发现,外源基因表达水平越高,重组质粒往往越不稳定,如果外源基因的表达受到抑制,则重组质粒有可能丢失,含有重组质粒的克隆细胞与不含重组质粒的宿主细胞的比生长速率可能相同。因此可以采取两阶段培养法,即在发酵前期控制外源基因不过量表达,使重组质粒稳定地遗传,9到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、转译效率使外源基因高效表达 。 1)可诱导性启动子。在构建表达质粒时,可以使用可诱导性的操纵子,如
15、lac,trp,PL等,在用含有这些启动子的克隆菌进行发酵生产时,可以选择培养条件使启动子受到阻遏(抑制)至一定时期,在此期间质粒稳定地遗传,然后通过去阻遏(诱导)使质粒高效表达。 2)温度敏感型质粒。在对质粒复制控制机制认识后,产生了一些温度敏感型质粒。温度较低时,质粒拷贝数较少;当温度升高到一定值时,质粒大量复制,拷贝数剧增,这种10质粒称为“runaway plasmid” 。 2.5 控制培养条件 克隆菌所处的环境条件对其质粒的稳定性和表达效率影响很大,对一个已经组建完成的克隆菌来说,选择最适的培养条件是进行工业化生产的关键步骤。环境因素对质粒稳定性的影响机制错综复杂。前述施加选择压力
16、和控制基因过量表达 2种方法也是通过培养条件的控制来实现的。在环境因素中,培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率 3个方11面尤为重要 。26 1)培养基的组成。微生物在不同的培养基中进行不同的代谢活动。对克隆菌来说,培养基组分可能通过各种途径影响质粒稳定地遗传。Imanaka 等研究了 2 种培养基对克隆菌12稳定性的影响,结果如表2所示 。由表2可以说明,质粒在丰富培养基 PBB 中比在最低限培养基 MM中更加不稳定,其不稳定的类型也不相同。培养基引起质粒 RSF 2124-trp结构性不稳定,而对质粒 pSC 101-trp来说,则是分配性不稳定。表 2 培养基对克隆菌稳定性的影响f
17、2025(%) 克隆菌 培养基 不稳定类型 PBB 7 结构型 W 3110 trp AE1Trp Rtna A RSF 2124-trp MM 99 结构型 PBB 7 分配型 W 3110 trp AE1Trp Ram27 pSC 101-trp MM 99 分配型2)增减温度。重组质粒引入细胞后,引起细胞发生一系列生理变化。据报道重组质粒会引起宿主细胞生长温度范围的变化,如 B.stearothermophilus的生长温度范围是 4070C,而 B.stearothermophilus(pLP11)的生长温度范围是 4063C,由于重组质粒的导入,使克13隆菌生长温度的上限降低 。一般
18、来说,低温有利于重组质粒稳定地遗传,当培养温度低于 50C 时,重组质粒很稳定,而当温度高于 50C时,重组质粒在间隙培养的对数后期和13连续培养时均表现不稳定性 。 3)菌体比生长速率。菌体比生长速率反映了环境因素,如培养基组成、温度、pH、氧传递等对菌体代谢的影响。比生长速率对重组质粒稳定性影响结果不尽一致,可能与克- +隆菌本身和培养条件有关。如果m不大于m ,则重组质粒的丢失不会导致非常严重的后果,因此调整这 2种菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性。但这往往很难实现,因为大多数环境条件同时提高或降低这 2种菌的比生长速率。在某些情况下,可以利用分解代谢11物效应控制菌的比生长速率,
19、降低a值,提高重组质粒的稳定性 。 总之,在影响重组质粒稳定性的诸多因素中,宿主细胞的遗传特性、重组质粒的组成和克隆菌所处的环境条件等三方面更受人们的重视。从分子水平讲,影响某些质粒稳定性的基因顺序已经定位;从细胞水平来看,有可能选择一些具有特定遗传背景的细胞作为宿主获得比较稳定的克隆菌。但这两方面尚需从广度和深度上进一步研究,以期抽象其本质,从根本上提高重组质粒的稳定性。另一方面,在目前还不完全明了影响质粒稳定性的原因的情况下,从工程水平上来研究影响重组质粒稳定性的各种因素及其对发酵生产的影响十分必要。 重组质粒的稳定与否关系着重组 DNA技术走向产业化之路的成败。这一问题的解决,需要多方面的努力。27