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1、基因工程的工具,南京市燕子矶中学 王明明,基因工程的概念,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切拼接导入表达,基因重组,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与表达,基因工程一般操作步骤,基因工程需要哪些特殊工具？,分子手术刀 限制性核酸内切酶 分子针线DNA连接酶 分子运输车载体,限制性核酸内切酶的特点及作用,每种限制性核酸内切酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA 分子。,特异性,在实际操作过程中： 限制性核酸内切酶是如何发挥作用的？,磷酸二酯键,认一认，画一画：,TTCTTGATGGAATC
2、TCGAATTCAGTCTGTCT AAGAACTACCTTAGAGCTTAAGTCAGACAGA ACTTCGATGGATTTAGGGCCCTTCTCCCCA TGAAGCTACCTAAATCCCGGGAAGAGGGGT,TGATGGAATCTCG AATTCAGTCT ACTACCTTAGAGCTTAA GTCAGA ACGATGGATTTAGGG CCCTTCTCCCCA TGCTACCTAAATCCC GGGAAGAGGGGT,黏性末端,平末端,思考：1.上面的末端各有几个游离的磷酸基团？ 2.将两个相同的黏性末端再连接起来的是哪种工具在起作用？ 它有什么特点？,在实际操作过程中： 限
3、制性核酸内切酶是如何发挥作用的？,磷酸二酯键,DNA连接酶的特点和作用,将两个相同的黏性末端之间连接起来，即恢复被限制性核酸内切酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 无特异性,有一或多个限制酶切点 有一个或多个标记基因， 便于筛选 导入基因能在受体细胞 中复制、表达 对受体细胞无害,载体的特点和作用,质粒、噬菌体以及一些动植物病毒,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与表达,基因工程一般操作步骤,GATGGAATTCTTTCTTCAGTCGAATTCTGTCT CTACCTTAAGAAAGAAGTCAGCTTAAGACAGA ACTTGGATCCCGATA
4、GAATTCTCCCCAATC TGAACCTAGGGCTATCTTAAGAGGGGTTAG,目的基因甲,载体甲,多个EcoRI组酶切后的载体与目的基因混合之后，加入DNA连接酶，连接产物是否只有一种？,载体目的基因（正向） 载体目的基因（反向） 载体载体（正、反） 目的基因目的基因（正、反） 载体自身环化 目的基因自身环化 ,原因：一种限制酶切割后产生的黏性末端只有一种，相同的黏性末端之间可以任意连接。,基因工程,?,有一或多个限制酶切点 有一个或多个标记基因， 便于筛选 导入基因能在受体细胞 中复制、表达 对受体细胞无害,载体的特点和作用,质粒、噬菌体以及一些动植物病毒,GATGGGATC
5、CTTTCTTCGAATTCAGTCTGTCT CTACCCTAGGAAAGAAGCTTAAGTCAGACAGA ACTTGGATCCCGATAGAATTCTCCCCAATC TGAACCTAGGGCTATCTTAAGAGGGGTTAG,目的基因乙,载体乙,双酶切： 1.保证目的基因的定向插入。 2.提高DNA的重组率。,拓展提高 筛选含目的基因的重组DNA,载体特点中除有多个酶切位点外，还携带标记基因。,在基因工程的实际操作中，科学家选择的载体往往含有两个或更多的标记基因。,如果在目的基因的插入位置有一个标记基因，当目的基因插入后，标记基因将被破坏而无法表达，从而达到筛选目的。,目的基因,练
6、一练,（2010江苏）27,【答案】（1）0、2 （2）高 （3）Sma会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因 （4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化 （5）DNA连接 （6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞 （7）蔗糖为唯一含碳营养物质,（2012江苏）32,答案：(1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖 (2)平 537 bp、790 bp、661 bp (3)4 （4）BamH 抗生素B 同种限制酶切割形成的末端相同, 部分目的基因D与质粒反向连接,下表为几种限制性核酸内切酶识别的序列和切割的位点。如图，已知某DNA在目的基因的两端1、2、3、4四处有BamH或EcoR或Pst的酶切位点。现用BamH和EcoR两种酶同时切割该DNA片段（假设所用的酶均可将识别位点完全切开），下列各种酶切位点情况中，可以防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状的是（ ） A1 为BamH，2为EcoR，3为BamH，4为Pst B1 为EcoR，2为BamH，3为BamH，4为Pst C1 为Pst，2为EcoR，3为EcoR，4为BamH D1 为BamH，2为EcoR，3为Pst，4为EcoR,谢谢！,