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1、石蜡切片制备基本步骤一、准备工作（一）（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗） 1.用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷 2.将器皿在自来水下冲洗干净 3.将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干 注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过13次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内1224小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗13次,烘干备用。 （二）硫酸洗液的配制 称取5g重铬酸钾粉末，置于250ml烧杯中，加10mL水使其溶解，然后慢慢加入100mL浓硫酸，溶液温度将达80，待其冷却后贮存于磨口玻璃瓶内。（三）载玻片与盖玻片的处理1.将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入洗液
2、中浸泡24小时 2.流水冲洗至无色，再用蒸馏水冲洗3遍 3.95%100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用。二、准备工作（二）常用液体的配制 （一）缓冲溶液：10.02M PBS(pH7.2-7.6)：1000ml蒸馏水中加氯化钠8.5g，磷酸氢二钠2.8g，磷酸二氢钠0.4g。如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。20.01M枸椽酸盐缓冲液（pH6.0）：1000ml蒸馏水中加枸橼酸三钠（C6H5Na3O72H2O）3g，枸橼酸（C6H8O7H2O）0.4g。（二）固定剂：10%甲醛：福尔马林100ml加蒸馏水900ml （三）染色液 1.Harris苏木精液 A液： 苏木精 1g
3、无水酒精 10ml B液： 铵矾或钾矾 20g 蒸馏水 200ml 氧化汞 0.5ml 冰醋酸 8ml 将矾溶于水，加热溶解（B液），稍冷后将苏木精酒精液（A液）混入B液，加热，稍冷却，加氧化汞，再继续加热1分钟，染液变为紫色，注意在加氧化汞时宜逐渐少量加入，防止染液溅出。全冷后呈深紫色，将烧杯口用纱布盖好，隔夜过滤，在过滤液内每96 ml中加4 ml冰醋酸，放置1周后成熟，即可用于染色，保存期12个月。此染液在加醋酸后，对核染色特具选择性，故很适于脱落细胞的核染色。由于染液内已加有氧化剂，故不能长期储存，但利于配后即用。 2伊红 伊红 510g 70%90%酒精 1000ml 冰醋酸10滴
4、（四）其它 盐酸洒精:多用于多种染色过程中的分色，如苏木精染色后分色。配法是在100ml的70酒精内加0.51ml的浓盐酸(Hcl)。用盐酸酒精分色后要经自来水充分冲洗组织切片，去除所含的酸再作其他处理。 三、水洗 固定后的组织块置水龙头下以自来水流水冲洗 24小时。冲洗好的组织可存放在75%酒精内。四、脱水包埋（一）脱水 70%乙醇 72小时 80%乙醇 24小时 95%乙醇 12小时 95%乙醇 12小时 100%乙醇 1小时 100%乙醇 3小时 （二）透明 酒精：二甲苯=1：1 2030分钟二甲苯 2小时二甲苯 1小时（三）浸蜡、包埋（石蜡包埋法） 1浸蜡在6062恒温蜡箱中放置2个蜡
5、杯，分别编号1（5658）、2（6062），其中分别盛软蜡、硬蜡，取透明好的组织块放入软蜡中1小时，迅速取出放入硬蜡，同样放置1小时。如果时间来及包埋，可以将已经完成浸蜡的组织块取出放在温箱外，第二天继续。 2包埋准备包埋蜡：一般应用硬蜡（5658或6062）为好，所用的石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复熔凝，并有一定的粘韧性，可以加一些蜂蜡。蜡的熔点应与组织的硬度相适应。包埋用过的石蜡可以反复使用。 准备包埋框：用金属。 点燃酒精灯，准备好无齿尖镊子，需作标记应先写好标签。 在金属框中倒入硬蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中，置好方向。可室温下冷却。 包埋框或纸盒内的蜡逐渐凝结，若表面已凝
6、结形成一层固体状，即可放入冷水中，加速其凝固。 待蜡块完全凝固以后，便可拆卸包埋框架，取出蜡块。 五、石蜡切片制备（一）石蜡切片前的准备 1切片刀。传统的切片刀在使用之前，一定要在显微镜下检查刀口的损伤程度，然后进行磨刀。现在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。 2修整蜡块：切去组织周围过多的石蜡，一般情况下在组织周围留有约12mm的石蜡边，两边必须平行。 3蜡块固定：修整好的蜡块先固定在事先准备好的小方木块或者金属块上，固定方法是把蜡铲先在酒精灯上加热，再将蜡块底部烙熔，迅速烙粘在小方木块或金属块底座上。 4载玻片擦洗干净后，在其表面涂上粘附剂（多聚赖氨酸）。 5准备好毛笔、镊子、染色架。 6
7、调好展片器内水的温度（45），有时也可以加些酒精到水中。 （二）石蜡切片 1将切片刀装在刀片机的刀架上并固定紧，固定蜡块底座或蜡块，调整蜡块与刀至合适位置，刀刃与蜡块表面呈5度角。 2切片多使用轮转式切片机，切片时，左手执毛笔，右手转切片机转轮，先修出组织块。 3调整切片机上的切片厚度为47m，然后切片。 4切片可以是单张，也可以是连续切片形成蜡带 5展片和捞片： 温水漂浮法：此法用展片机或者用恒温水浴箱，先使水温保持在4550，用左手拿毛笔轻轻托起切片，用右手用眼科镊子夹起切片的一角，正面向上轻轻平铺放置于展片器的水面上，动作要轻快，切好的石蜡切片漂浮在温水中受热后及在表面张力的作用会自然平
8、整地展开，必要时可用眼科镊轻轻拔开，然后捞片，并及时编号。 6展好的切片在室温下稍微干燥后，放在40恒温烤箱中，小片组织30分钟即可，大的需1224小时，烤干备用。 六、H-E染色1脱蜡 二甲苯I 1小时二甲苯II 1小时2水化 100%酒精I 5分钟 100%酒精II 5分钟 95%酒精I 5分钟 95%酒精II 5分钟 85%酒精 5分钟 75%酒精 5分钟 蒸馏水冲洗 1分钟 3染色 苏木精染色 5分钟 自来水洗 盐酸酒精分化 15秒 自来水洗（镜检） 自来水洗 15分钟 蒸馏水洗 1小时 75%酒精 2分钟 85%酒精 2分钟 0.5%伊红染色 1分钟 95%酒精I 5分钟 95%酒精
9、II 5分钟 100%酒精I 5分钟 100%酒精II 5分钟 二甲苯I 15分钟 二甲苯II 15分钟 4封片 中性树胶封片 上述处理好的玻片，取中性树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐步盖下去，避免发生气泡 九、石蜡切片免疫组化染色方法（二步法）（一）试剂：1、0.01M(pH7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），稀释抗体和洗片子用；2、清洁液、纯水，洗玻片用；3、多聚赖氨酸：处理载玻片，防止脱片；4、梯度酒精：脱水；5、二甲苯：透明；6、柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）：抗原修复液；7、3%H2O2：灭活内源性过氧化物酶；8、浓缩型DAB试剂盒：显色液；9、中性树胶：封片液；10、一抗
10、：Rabbit polyclonal to Glutathione Peroxidase 1,Abcam；Rabbit polyclonal to TXNRD2，Abcam。11、二抗：抗兔非生物素二步法免疫组化检测试剂（PV-6001，中杉金桥生物技术有限公司）。 (二) 仪器：1、切片架2、孵育盒3、烤箱4、移液器5、小玻璃染色缸6、水浴锅（三）具体步骤：1、石蜡切片置于60烘箱中，烘片30分钟。2、二甲苯脱蜡：I、II各20分钟。3、梯度酒精脱蜡至水：100% I、100%II、95%、90%、80%各5分钟，双蒸水洗5分钟2次。4、抗原热修复：将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中，置微
11、波炉内加热，使容器内液体温度保持在98左右，并持续1015分钟。取出容器，室温冷却2030分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗5分钟3次。5、用滤纸把组织周围的液体吸干，每张切片加1滴3% H2O2，放入孵育盒中，盒底部放少量双蒸水。把盒子放入37水浴箱中孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS洗5分钟3次。6、用滤纸把组织周围的液体吸干，每张切片加1滴（3050ul）适当比例稀释的一抗（GPx1为1:375，TrxR2为1：75），37孵育12小时或4过夜。PBS洗5分钟3次。 7、用滤纸把组织周围的液体吸干，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液，显色35分钟，显微镜下掌握显色程度，见黄褐色斑，放入双蒸水中终止显色。8、苏木素复染3分钟，自来水冲洗30秒钟，盐酸酒精分化5秒钟，自来水冲洗15分钟。9、梯度酒精脱水：80%、90%、95%、100% I、100%II各5分钟。10、二甲苯透明：I、II各10分钟。11、中性树胶封片。12、放入60烘箱中烤干，显微镜下观察。