日积月累-常用液相色谱柱的规范化使用与保养标准操作程序.docx

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1、1 目的规范液相色谱柱的使用与管理；液相色谱柱标准化老化与再生；剖析液相色谱柱常见问题与解决办法。 延长色谱柱使用寿命， 降低色谱柱使用成本。 提高分析人员液相色谱柱使用与维护水平。2 范围本SOPS用于#使用色谱柱的仪器分析操作人员及相关管理人员。3 责任本程序由新药研发部组织实施，#备仪器操作人员具体执行。4 定义液相色谱柱： 指用于液相色谱分离的柱形固定相， 由柱管、 压帽 / 卡套、 筛板 (滤片)、填料、接头等组合而成，可用于液相色谱分析与制备。色谱柱再生： 指色谱柱在非正常情况下， 针对异常现象及原因采取的一系列修复补救措施，以提高色谱柱柱效和延长其使用寿命的处理过程。运载溶剂(S

2、hipping Solvent) ： 指色谱柱生产厂商在柱出厂测试合格后饱和于色谱柱内的合适溶剂，以利于运输保存，多与保存溶剂相同。保存条件(Storage Conditions) ： 指色谱柱生产厂商根据不同柱类型及其色谱柱填料的制备、键合、装填、高压定型、净化干燥等工艺条件的不同要求而特别制定的色谱柱保存前净化饱和的处理程序与储存条件， 包括净化程序、 净化溶剂和保存溶剂、保存条件。保存溶剂( Storage Solven)t ： 用于保存色谱柱并指定了溶剂组成与比例的溶液。5 程序5.1 液相色谱柱的分类目前，我公司色谱分析涉及到的液相色谱柱主要有6 大类，具体详见5.2。5.2 液相色

3、谱柱的使用与保养(仅列举常用分析柱)5.2.1 液相色谱柱的老化处理与使用保养程序新购色谱柱出厂前均采用适合的运载溶剂(Shipping Solvent)饱和，密封，由于运输过程周期较长， 柱床容易干涸， 所以新柱使用前需重新饱和与老化。 若老化方法不正确或时间不够， 极易导致色谱柱在使用较短时间后即产生分离度下降、 峰形变差、 峰拖尾等柱效降低的情况。 需根据色谱柱不同类型选择不同饱和与老化方法。1、普通 C8及 Ci8反相色谱柱(C8&C18 Reversed-phase chromatography column)：( 1)准备新鲜超纯水及色谱级乙腈或甲醇，冲洗色谱仪器系统，保证仪器系统

4、管路干净。 (新柱老化前，此步决不可忽略)(2)将色谱柱反向连接，不接检测器。用水-有机相(90: 1095:5),以0.30.6ml/min流速冲洗2030min。(目的是冲洗出柱入口端无机杂物与筛板 孔杂物，使筛板正常)(3)再将色谱柱正向连接，不接检测器。用水 -有机相(90: 1095:5), 以0.30.6ml/min流速冲洗2030min。(目的是冲洗出柱出口端无机杂物与筛 板孔杂物，使筛板正常)(4)连接检测器，开启柱温达30c40C,用水-有机相(90: 1095:5), 以0.30.6ml/min流速冲洗4h以上。(目的是充饱和色谱柱，去除柱内空气)(5)用水-有机相(10:

5、 905:95),以0.30.6ml/min流速冲洗2h以上或 在120min内以水-有机相(95:50:100)梯度变化，以0.30.6ml/min流速冲洗- 再用100%有机溶剂，以0.30.6ml/min流速冲洗1h以上-最后用100%有机溶 剂，以 1ml/min 流速冲洗 1h 以上。 (目的是老化色谱柱)（ 1） 平衡前根据水相-有机相的比例，首先调整水- 有机相的比例接近流动相水相-有机相的比例，以1ml/min 流速冲洗 30 左右(目的是相平衡过渡) 。如果流动相中含有缓冲盐， 决不可在柱老化后立即用流动相平衡， 必需先用 90%以上水进行预平衡30min 以上， 否则， 会

6、导致缓冲盐在柱内析出结晶 ， 严重时会将新柱永久不可逆地损坏。（ 2） 更换成新制并经0.45um滤膜过滤，超声脱气后的流动相，按检测 方法平衡至少1h,待基线稳定后，开始进样检测。（ 3） 于是新柱首次使用，在进样完成后需立即对色谱柱进行净化和有机溶剂饱和。方法是：用水-有机相(90: 1095:5),以0.6ml/min流速冲洗1h以 上再用水-有机相(90: 1095:5),以1ml/min流速冲洗30min以上(或者采 用溶剂梯度变化至100%有机相冲洗120min以上)f最后用100%有机溶剂，以1ml/min 流速冲洗 1h 以上。若流动相中有缓冲盐，建议用 100%水冲洗 1h

7、以上后，再重复上述净化程序（但个别品牌C8或C18色谱柱不耐受纯水冲洗者例外）。在新色谱柱使用几次，均正常后，运行完毕 净化处理程序可简化为： 用水 - 有机相（90: 1095:5）,以1ml/min流速冲洗1h以上-再用100%有机溶剂， 以1ml/min流速冲洗30min以上-选择柱说明书中保存条件（Storage Condition） 规定的保存溶剂（Storage Solvent冲洗10倍柱体积以上-封口，保存。（ 4） 化完毕，若次日不再使用，可取下色谱柱，用封头螺丝密封，交色谱柱管理人员入库保存于防尘环境下，备案。（ 10） 备注：老化用有机溶剂推荐使用色谱级甲醇， 不同品牌色谱

8、柱需区别对待；水需用去离子的超纯水。若色谱柱使用后入库保存，长时间未使用，重新使用时仍需重新饱和。方法是：用水-有机相（90: 1095:5）,以0.6ml/min流 速冲洗1h以上-再用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗30min以上然后调 整水 -有机相的比例接近流动相水相-有机相的比例，以 1ml/min 流速冲洗 30左右-最后用流动相平衡1h以上，进样检测。必需注意流动相pH值不能超过色谱柱 pH 耐受范围，过酸容易使键合相变态，过碱则易导致硅胶溶解柱床塌陷。（ 11） 特别提示： 当供试品溶液中含有一定量表面活性剂，多次进样后，由于表面活性剂会在筛板及硅胶表面形成表面膜，

9、导致峰变宽、 拖尾甚至分叉。 此 时，处理方法如下：将色谱柱反向连接接，不接检测器，用水-乙月青（90: 1095:5）,以0.6ml/min流速冲洗2h以上-再用100%乙月青，以0.6ml/min流速冲洗 1h以上-然后正向连接好色谱柱，用水-乙月青（90: 1095:5）,以1ml/min流速 冲洗1h以上-再用100%乙月青，以1ml/min流速冲洗1h以上，即可恢复。（ 12） 警告： 无论何时，必须保证色谱柱柱床不干涸，尤其是进样检测和柱冲洗过程中不能让流动相长时间（ 30min 以上）走空，否则易使色谱柱干涸且带入大量几乎无法排出的气泡， 甚至导致柱床局部塌陷或中部开裂。 使用与

10、保存时，严禁用力甩， 绝对杜绝不小心猛烈撞击或高处掉落， 否则， 易导致柱床机械性损 坏，则再无再生可能。2、正相色谱柱（Normal 干hase Chromatography columD：目前，正相色谱分析最常用的是氨基柱与氰基柱。（ 1）氨基柱（-NH2） ： 氨基柱可以同时用于正相条件和反相条件，但多用于正相色谱条件。 使用时需注意， 正相反相交替使用时必需用异丙醇过度， 保证 柱保存溶剂与流动相互溶。新购氨基柱老化处理及使用基本程序如下：1）若需要在正相条件下使用 ：用正己烷-乙腈（99： 1）以 0.5ml/min 的流速冲洗约 50 倍柱体积备注：氨基柱出厂保存溶剂多用正相溶剂，

11、eg.正己烷-乙月青（99: 1）。再根据待分析用正相流动相极性选用极性相近的氯仿或二氯甲烷以相同的流速冲洗约 10 倍柱体积。用正相流动相平衡1h 以上，确保柱压控制在6000Psi 以内，以防止柱头塌陷。待基线平稳后，进样检测。如果要使用的流动相中含有缓冲盐类，在使用流动相平衡之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，冲洗约 10 倍柱体积， 避免缓冲盐在分析柱内析出。分析完毕，用异丙醇，以0.5ml/min流速冲洗色谱柱约30倍柱体积-再 用甲醇，以1ml/min流速冲洗色谱柱约10倍柱体积-再用异丙醇，以0.5ml/min 流速冲洗色谱柱约 10 倍柱体积。若使用的分析用流动相中含有缓冲

12、盐类，分析完毕需先用不含缓冲盐的同比例流动相冲洗约 30 倍柱体积， 再按上述方法冲洗。再用色谱柱说明书中规定的正相保存溶剂以 1ml/min 冲洗约 10倍柱体积，保存即可，一般用正己烷-乙腈（99： 1） 。重新在正相条件下使用时，重复上述过程即可，时间可适当减少一 半左右。2）若需要在反相条件下使用：先用正己烷-乙月青（99: 1）以0.5ml/min的流速冲洗约30倍柱体积-再依 次以0.5ml/min的流速，用等量的氯仿-异丙醇-甲醇-甲醇-水（50: 50）分别 冲洗柱子约10倍柱体积-再以0.5ml/min的流速，用pH11.0以下的氢氧化钠溶 液冲洗柱子约30倍柱体积（注意：p

13、H值切不可超过11.0）-立即用水以0.5ml/min 的流速冲洗柱子约30倍柱体积-最后换成反相流动相平衡1h以上，待基线平稳， 进样检测。 （备注： 若要使用的反相流动相中含有缓冲盐类，在用反相流动相平 衡之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，冲洗约 10 倍柱体积，避免缓冲 盐在分析柱内析出。在反相条件下使用时，要特别注意控制 pH 值范围及流动相 中水的比例， pH 值越低越易发生键合相水解，流动相中水的比例越高也越易发生键合相水解。 最理想的 pH 范围在 pH 3.0-7.0，决不允许超过11.0。）反相条件下使用完毕，净化处理程序同C18柱，但需注意，冲洗溶剂中有机相不能低于

14、10%；净化完毕，先用甲醇以0.5ml/min 的流速冲洗柱子约 10 倍柱体积-然后用异丙醇以0.5ml/min的流速冲洗柱子约10倍柱体积-最后用色谱柱说明书中规定的正相保存溶剂一般用正己烷-乙腈（99： 1） 以 1ml/min 冲洗约10倍柱体积-密封，保存即可。（ 2）氰基柱（ -CN ） ： 氰基柱可以同时用于正相条件和反相条件，但多用于正相色谱条件。 使用时需注意， 正相反相交替使用时必需用异丙醇过度， 保证柱保存溶剂与流动相互溶。新购氰基柱老化处理及使用基本程序与氨基柱基本相同，主要程序如下：1）若需要在正相条件下使用 ：用异丙醇或正己烷以 0.5ml/min 的流速冲洗约 3

15、0倍柱体积。 （备注：氰基柱出厂保存溶剂多用正相溶剂，eg正己烷或异丙醇。）再根据待分析用正相流动相极性选用极性相近的氯仿、 异丙醇或二氯甲烷以相同的流速冲洗约 10 倍柱体积。用正相流动相平衡1h 以上，确保柱压控制在6000Psi 以内，以防止柱头塌陷。待基线平稳后，进样检测。如果要使用的流动相中含有缓冲盐类，在使用流动相平衡之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，冲洗约 10 倍柱体积，避免缓冲盐在分析柱内析出。分析完毕，用异丙醇，以0.5ml/min流速冲洗色谱柱约30倍柱体积-再 用甲醇，以1ml/min流速冲洗色谱柱约10倍柱体积-再用异丙醇，以0.5ml/min 流速冲洗色谱柱约

16、 10 倍柱体积。若使用的分析用流动相中含有缓冲盐类，分析完毕需先用不含缓冲盐的同比例流动相冲洗约 30 倍柱体积， 再按上述方法冲洗。再用色谱柱说明书中规定的正相保存溶剂以 0.5ml/min 冲洗约 10 倍柱体积，保存即可，一般用正己烷或异丙醇。重新在正相条件下使用时，重复上述过程即可，时间可适当减少一 半左右。2）若需要在反相条件下使用：操作和21护与C18柱基本相同，但需注意，冲洗溶剂中有机相不能低于10%。新柱先用正己烷或异丙醇以0.5ml/min的流速冲洗约30倍柱体积-再依次以0.5ml/min的流速，用等量的水-乙月青（95:5） -THF （四氢味喃）-水-乙月青 （ 5:

17、95）分别冲洗柱子约 10 倍柱体积 最好再继续用水-乙腈（ 5:95）以0.2-0.3mL/min过夜冲洗-最后换成反相流动相平衡1h以上，待基线平稳，进样检测。 （备注： 若要使用的反相流动相中含有缓冲盐类，在用反相流动相平衡之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，冲洗约 10 倍柱体积，避免缓冲盐在分析柱内析出。在反相条件下使用时，要特别注意控制 pH 值范围及流动相中水的比例， pH 值越低越易发生键合相水解，流动相中水的比例越高也越易发生键合相水解。 最理想的 pH 范围在 pH 1.5-7.0。）反相条件下使用完毕，净化处理程序同C18柱；净化完毕，先用甲醇以0.5ml/min的流

18、速冲洗柱子约10倍柱体积然后用异丙醇以0.5ml/min的流速冲 洗柱子约10倍柱体积-最后用色谱柱说明书中规定的正相保存溶剂（一般用正 己烷或异丙醇）以0.5ml/min冲洗约10倍柱体积-密封，保存即可。3、阴 /阳离子交换色谱柱（ negion/cation exchange colum）n：阴 / 阳离子交换柱属于强离子交换柱，分为玻璃柱与不锈钢柱，多用不锈钢柱。阳离子交换柱填充硅胶基质，键合强阳离子基团，含有磺酸盐功能团，属于酸性离子柱， 特别设计用于常规HPLC 分析有机和无机阳离子。 阴离子交换柱填充硅胶基质，键合强阴离子基团，含有季胺碱功能团，属于碱性离子柱，特别设计用于常规H

19、PLC 分析有机和无机阴离子。 对于新柱而言， 二者老化、 使用与保养程序类似，主要方法如下：（ 1） 首先在开始使用系统以前检查柱子有否微生物生长， 否则柱子会堵塞，柱压会升高到无法接受的水平。然后，不接检测器，正向安装色谱柱，使用纯甲醇以 0.6ml/min 流速冲洗约 5倍柱体积。（2）再连接检测器，用纯甲醇以0.6ml/min 流速冲洗约 10倍柱体积。（3）然后使用去离子水以0.6ml/min 流速冲洗约 10倍柱体积。（ 4） 最好再确保连接好保护柱 （多使用相应柱制造商针对性提供的保护柱） ，再用选用的洗脱液以 0.6ml/min 流速平衡 1h 以上，进样检测。同样，若洗脱液中

20、含有缓冲盐类， 在用分析洗脱液平衡之前， 先用不含缓冲盐的同比例洗脱液过渡，冲洗约 10 倍柱体积，避免缓冲盐在分析柱内析出。（ 5） 特别提示：洗脱液要求是新制的低电导率缓冲液， 或者是有 UV 吸收的缓冲液。 对于 阳离子交换柱，多用柠檬酸或酒石酸缓冲液（或其混合溶液）、邻苯二甲酸缓冲液 ， pH 范围从 2.5 到 6.5；对于阴离子交换柱，多用磷酸缓冲液、硝酸铵溶液（ 1mMol/L ） ，邻苯二甲酸缓冲液， pH 范围从 2.5 到 6.5。绝对禁止使用水杨酸缓冲液， 因水杨酸分解产物会改变固定相的性质。 洗脱液在使用以前必须用 0.45 微米滤膜过滤并彻底脱气，以防止发生检测和泵送

21、问题。提倡在室温环境使用，为了提高分析的稳定性，可以设置高于室温510的柱温，最好不要在40以上使用。使用过程中不要超过其耐受最高压力（不锈钢柱：4500psi;玻璃柱：3000psi）。增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止柱床的扰动。更换柱子，必须先降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子，压力变化到0（约2 分钟）后再更换。必须防止将来自流动相或者样品中的疏水性或与流动相极性差别很大的化合物进入色谱柱，特别地，要绝对禁止导入颗粒杂质，以防止操作压力增高，污染物难以或者不能去除。（ 6）分析完毕，净化程序基本同Ci8柱，先用去离子水以0.6ml/min流速冲 洗约20倍柱体积-然后用甲醇

22、以0.6ml/min流速冲洗约10倍柱体积，纯甲醇饱 和后密封保存即可。（注意：一定要确保在柱子内没有缓冲液或者其他含盐类 的洗脱液的情况下保存色谱柱。）（ 7）长时间保存后重新使用，重复上述（1）-（6）即可。（ 8）使用并正确处理完毕，入库保存于防尘环境下，登记备案。（ 9） 特别说明： 部分离子交换柱的使用条件、保存溶剂与保存条件、预平衡溶剂与方法、 再生方法等有特殊要求。 eg.phenomenex Rezex ROA-Organic Acid H+（酸性阳离子柱）柱压必须控制在 600 psi 之内；流动相中有机相比例不得超过10%，流速应小间隔上升至0.6ml/min ，且不得超过

23、0.6ml/min ，降低流速亦然；柱子用超纯水饱和后保存于4左右冰箱中；运行时，柱温不超过85。分析完毕，用超纯水清洗30倍柱体积以上，密封保存。为防止色谱柱长时间保存时长菌，应使用 0.05mol/L左右的硫酸溶液(阳离子交换柱)或氨水溶液(阴离子交换柱)饱和后保存于4左右冰箱中。新柱或旧柱再次使用前均需先用去离子水，以 0.6mL/min 流速冲洗色谱柱约 30 倍柱体积，将柱内硫酸或氨水彻底洗出 然后用流动相平衡，进样检测即可。分析完 毕，先用去离子水，以0.6ml/min流速冲洗色谱柱约30倍柱体积-再用0.5mol/L 左右的 0.05mol/L 左右的硫酸溶液 (阳离子交换柱)

24、或氨水溶液 (阴离子交换柱)冲洗色谱柱约10倍柱体积-密封，保存即可。具体流速需根据柱长与柱内径选择，一般不允许超过0.6ml/min ，因流速过大易导致键合相随流动相流出。其他具体要求，请仔细阅读相关说明书，并以说明书为准。4、手性色谱柱( Chiral HPLC Column ) ：手性色谱柱( Chiral HPLC Column )是由具有光学活性的单体，键合在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相 (Chiral Stationary Phase) 。 通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异， 从而达到光学异构体分离的目的。 主要有刷(Brush)型或称为 Prikle 型、纤维

25、素(Cellulose)型、环糊精(Cyclodextrin) 型、大环抗生素(Macrocyclic antibiotics)型、蛋白质(Protein)型、配位交换(Ligand exchange型、冠醴(Crown ethers)型等类型，此类色谱柱可用于正 相系统与反相系统，多用于正相系统。常用的是蛋白质( Protein) 型， 其分离依赖于疏水相互作用和极性相互作用，大多可用于反相色谱条件。目前使用较多的是e酸性糖蛋白(a-Acid Glycoprotein, AGP)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA)、牛血清白 蛋白( Bovine Serum A

26、lbumin ， BSA )和卵类粘蛋白( Ovomucoid， OV) 。e酸性糖蛋白分子共价键合到硅胶上，制成的 AGP手性色谱柱，可以分离多种手性化合物，特别针对性设计应用于在反相条件下的使用；而HSA 及 BSA手性柱， 多键合在环糊精型担体上， 亦常用于反相色谱条件， 其使用与保养基本同反相柱， 且可以保存在纯乙腈等有机溶剂中， 使用与保养无特殊要求， 应用范 围较广，使用也较为方便。由于手性柱一般都较为昂贵，使用不当又极易导致损坏，且再生尤其困难，所以使用、维护与保养均需特别慎重，必须严格按照本SOP 及相应说明书进行。对于新的手性柱， 使用、 老化与保养程序基本类似， 但由于制造

27、商工艺条件各异，需要根据不同基质特点分析，参照并严格按照相应说明书进行处理。一般（以AGP 柱为例）主要程序如下：（ 1）将色谱柱接到色谱仪器之前，必须先用合适的溶剂冲洗流路（包括六通阀和定量环）。绝对杜绝流路中残存丙酮、氯仿、DMF （二甲基甲酰胺）、DMSO （二甲基亚碉）、乙酸乙酯、二氯甲烷、THF （四氢味喃）等，以防止破坏手性固定相。 如果在进样检测， 进样间隔的洗针液必须更换成合适的溶剂， 最好是15%20%的异丙醇溶液。然后连接好色谱柱，不接检测器，用纯水以0.5ml/min流速冲洗约20min。（注意：流速需小间隔从0升至0.5ml/min）（2）连接检测器，再用纯水以0.5m

28、l/min 流速冲洗约 120min。（ 3）用15%以内的异丙醇溶液以0.5ml/min 流速冲洗约 60min。（ 4）再用纯水以0.5ml/min 流速冲洗约 60min。（5）用流动相以不超过0.8ml/min流速平衡约1h直至基线平稳，进样检测。（ 6） 分析完毕，用纯水以 0.5ml/min 流速冲洗约 60min ， 以彻底洗出缓冲盐，然后用15%以内的异丙醇溶液以0.5ml/min流速冲洗约30min,密封，保存于10c 左右环境中，登记备案。（ 7） 特别注意：必须确保柱压在50bar100bar之间，一定不要超过100bar。流速一般不大于 0.8ml/min ，具体应以不

29、超过色谱柱使用压力上限为准。升高或降低流速均需以小间隔逐步升高或降低。提倡在室温下使用，但一般要求柱温不超过25 C。要特别注意流动相及样品溶解溶液的pH值，最佳pH范围为4.07.0,切不可超过10.0，以防止硅胶溶解而损坏填料，所以pH 最好不要超过8.0。否则，极易导致手性分离不佳、色谱峰严重变宽、色谱峰拖尾及分叉等。 强碱性溶液的导入，尤其容易导致手性柱不可逆损坏，无再生可能而彻底报废！以上（1）（6）是在反相条件下使用情况，如果要换成正相使用，必需先用100%异丙醇以0.5ml/min 流速冲洗约 30min 过渡，其他要求同上。色谱柱保存时，必需保证柱内无缓冲盐或其他盐类物质残存。

30、手性柱在使用过多次且正常后，可简化上述程序，将时间适当缩短即可。（ 8） 特别建议：当分离分析酸碱性手性化合物时， 有必要在流动相加入少量电荷迁移添加剂（浓度不超过10mMol/L ）来提高手性柱的手性选择性。常见的有：分离酸性化合物时，添加酸性添加剂如三氟乙酸（TFA） 、乙酸 （Acetic acid） 、甲酸（Methanoic acid）、七氟乙酸（HFBA）、辛酸（OA）,浓度0.01%0.5%;分离 碱性化合物时，添加碱性添加剂 如二乙胺 （DAE） 、三乙胺（TAE ）、丁胺（Butylamine, BAE）、乙醇胺（Ethanol amine, EthAE）、N, N-二甲胺（

31、DMOA ）,浓 度 0.01% 0.5%。辛酸（OA）及N, N-二甲胺（DMOA）与水的互溶性有限，在常温下， 仅仅2mMol/L （OA）或5mMol/L （DMOA）能均一的溶解于水中，若超此限度， 将分层。因此，需特别注意两者水溶液的浓度。由于上述电荷迁移添加剂与手性柱柱床有很好的亲和力，难以从柱上洗 除， 长期使用可能会导致柱性能下降。 因此， 建议添加上述电荷迁移添加剂使用后的手性柱应作为某一品种分析专用柱。（ 9） 特别说明：部分手性柱（以AGP柱为例）使用前要求用10mMol/L的醋酸钱缓冲液 （Ammonium acetrate Buffer,冰醋酸调 pH至5.8）-异丙

32、醇（2-PrOH） （95:5）进 行预平衡。操作程序基本同上，不同在于：需先用纯化水以0.5ml/min流速冲洗色谱柱30倍柱体积以上-再用10mMol/L的醋酸钱缓冲液（Ammonium acetrate Buffer,冰醋酸调pH至5.8）-异丙醇（2-PrOH） （95:5）以0.5ml/min流速冲洗色 谱柱30倍柱体积以上然后用纯化水以0.5ml/min流速冲洗色谱柱10倍柱体积以 上-最后用流动相平衡1h以上，进样检测即可。分析完毕，净化保养程序同上 （1）（6）。部分HSA及BSA手性柱，使用保养程序较为简易。即先用水-有机相（95:5 或100:0）,小间隔升高流速至0.5或

33、1ml/min,冲洗约30柱体积-再用流动相平 衡1h左右，进样检测即可。分析完毕，用水-有机相（95:5或100:0）,小间隔开 高流速至0.5或1ml/min ,冲洗约30柱体积-然后用100%有机溶剂（一般多用乙 月青）同流速冲洗约10倍柱体积-再以小间隔将流速降至0f密封，保存即可。5、亲水性色谱柱（Hydrophilic chromatographic column， HILIC ）：亲水性色谱是正相色谱的一个变种。 HILIC HPLC Column 亲水性色谱柱是以超纯硅胶为基质，表面键合有二氧化硅（silica,弱酸性），氟基（cyano,弱酸 性）,二羟基（diol,中性），

34、二丙基乙酰胺基（valpromide,弱碱性），丙基酰 胺基 （Venusil ， 弱碱性） ， 氨基 （ amino， 弱碱性） , 吡啶基 （ Pyridine ， 弱碱性） ， 咪唑基（ Imidazole ，弱碱性）等亲水基团的极性固定相。可用于正相、反相和亲水液相色谱， 是代替氨基柱和硅胶柱的最佳选择。 与传统硅胶柱相比， 具有更好 的重现性和柱寿命。HILIC HPLC Column 亲水性色谱柱分离机理目前还存在着争议， 主要包括以下三个方面：I .分配机理、H .离子交换、m.偶极-偶极相互作用。而更多的试验 现象则表明 HILIC 的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等

35、多种次级效应，很难将其区分开来。HILIC HPLC Column 亲水性色谱柱适合于分离在反相色谱柱上不保留的极性化合物， 尤其是对强极性碱性化合物的保留能力强， 因此， 其成为研究药物代谢、药物发现和组合化学科学的首选，尤其适用于LC-MS及LC-ELSD。通常主要用于分离水溶性极强的极性化合物，如有机酸（eg水杨酸）、糖类等。具检 测灵敏度可比使用反相色谱柱提高101000B。其使用与保养基本同正相色谱 柱，主要程序及注意事项如下：（1）新柱老化时，应采用水-乙月青（ 50:50）以0.40.8ml/min流速，冲洗至 少50柱体积进行一次预平衡-再用水-乙月青（ 30:70）以检测条件

36、流速，冲洗约 10倍柱体积进行二次预平衡。（ 2）再用初始流动相条件按检测方法冲洗约20倍柱体积进行初始平衡。（ 3）然后进样1至2针，进行进样平衡 。（ 4）再用初始流动相条件按检测方法冲洗约20倍柱体积进行最终平衡。（ 5）进样检测。（6）分析完毕，净化处理程序如下：首先用水-乙月青（90:10）以0.4 0.8ml/min流速，冲洗约30倍柱体积（洗出强极性物质）-再用水-乙月青（ 50:50）以0.40.8ml/min流速，冲洗至少50柱体积（洗出中等极性物质）-再用水-乙月青（10:90）以0.40.8ml/min流速，冲洗至少30柱体积（洗出弱极性物质及饱 和色谱柱）-密封，保存即

37、可（保存溶剂多为90%乙月青溶液，多保存于10c左右环境中）。（ 7） 特别注意：进样检测时，必需要保证流动相中至少含有40%左右的有机相（以乙月青多用） 。 流动相中若需使用添加剂时， 一般避免添加离子对试剂， 推荐使用醋酸铵、甲酸铵以提高进样重现性， 但要谨慎使用磷酸盐等无机盐， 以避免沉淀在柱内析出 （因其在较高浓度有机溶剂下难溶）。 可以使用但一般不建议使用甲酸等低分子量低黏性酸， 且浓度多用 0.2%， 最好不要使用磷酸（因其黏度较大，易固定保留在固定相上，且易导致保留时间漂移）。 流动相pH稳定范围一般为1.5-8.0。梯度洗脱时，不允许从100%有机相（因为100%的乙月青可能不

38、利于HILIC色谱柱中亲水基团部分键合相的伸展，使得保留性能下降。）到100%水相，必需保证至少含有40%左右的有机相（以乙月青多用）。由于 HILIC柱的固定相是亲 水性的，且在一定pH值范围内是带电荷的，而HILIC的流动相是作为固定相的一 部分来起作用的，因此必需在流动相中保持一定量的水相（比例保持在 5% 60%）。等度洗脱时应注意避开流动相比例拐点。一般情况下，使用 HILIC柱时，有机相比例增加，保留时间会延长，但HILIC 柱在 60%左右比例的有机相时会有一个拐点， 即随有机相比例增高， 保留时间缩短。 具体的拐点比例与生产厂商的填料有关，一般在50%-60%比例的有机相之间。

39、（ 备注： 亲水色谱填料设计的初衷是为 MS 设计的， 目的是使极性化合物在高有机相的环境下有保留。所以使用 HILIC 柱时，无论是等度洗脱还是梯度洗脱， 不能使用 100% 的乙腈， 推荐使用到95%就可以了；不推荐使用含乙腈60%以下的流动相， 因为水相超过40%是没有意义的， 如此，虽然梯度范围较小，但是足够用了。 ）过滤样品溶液时， 避免使用带有橡胶密封圈的针管， 而应使用玻璃针筒及不锈钢针。样品溶解溶剂最好是100%的有机相（但往往无法实现），最好不用纯水，而应该保证有机溶剂至少40%的比例。应根据色谱柱型号选择进样体积，一般：550 n L for 4.6 mm i.d. col

40、umn0.55 n L for 2.1 mm i.d. column进样器与进样针及进样间隔的清洗溶液， 推荐使用含有95%有机相的水溶第 13 页， 共 20 页液或与流动相组成及极性相似的混合溶液（不含缓冲盐及其他试剂）HILIC色谱柱的最佳流速范围 是0.40.8ml/min ,但需根据色谱柱型号选 择，一般为：1.0 mL/min for 4.6 mm i.d. column ； 0.2 mL/min for 2.1 mm i.d. column o柱温无特殊要求，但不允许高于色谱柱说明书规定的最高耐受温度。6、氨基酸分析柱（Venusil AA）:氨基酸分析柱（Venusil AA）

41、是一种改良的Ci8柱，基于阳离子交换柱分离、 柱后西三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法（ IEC）、反相分离原理等， 对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分进行含量分析。每一根色谱柱均经 过严格的18种氨基酸的分离检测，保证了结果的可靠性。特别适用于分析酸性和 酸不稳定性氨基酸，以及用阳离子交换分离不完全的氨基酸对。其使用与保养与C18柱基本相同，主要程序及注意事项如下：（1）仪器基本结构与普通HPLC相似，但需针对氨基酸分析进行细节优化（添加西三酮试剂防氧化氮气保护装置、惰性管路、在线脱气、洗脱 梯度及柱温梯度控制、溶液和样品的制冷控制等特殊模块）。（2）需根据具体分析样品的要求选择合适的色

42、谱系统。通常分为两种 系统：蛋白水解分析系统（钠盐系统）和游离氨基酸分析系统（锂盐系统）： 利用不同浓度和 pH值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。其中钠盐系统一次最多分析约 25种氨基酸，速度较快，基线平直度好；锂盐系统一次最 多分析约50种氨基酸，速度较慢，基线一般不如钠盐系统好。（3）需根据具体分析样品的要求选择合适的样品衍生方法（使其具有 紫外吸收或荧光发射特性）。通常有柱前衍生与柱后衍生两种：一般采用 柱前衍生法，因其与柱后衍生法相比具有以下优点：固定相采用 C18（反相色谱）柱，可分辨分子结构细小的差异；流动相为极性溶剂，如甲醇、乙 二月青等，避免对荧光检测的干扰，可提高灵敏度及检

43、测速度；不需要添 加额外的反应器和泵，可实现色谱仪一机多用。但随着氨基酸自动分析仪 的技术水平提高，现趋向于使用柱后衍生法，如甫三酮柱后衍生反应。本 法需额外的添加柱后反应器和泵，使经色谱分离的各种氨基酸与西三酮反 应生成的蓝紫色化合物（570nm）,其颜色深浅与各有关氨基酸的含量成正比。但脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物（440nm）,需在另外波长处定量测定。（4）样品必须经正确预处理后进样检测，包括：检测游离氨基酸含量时，需先除去脂肪杂质后，冉上柱分析。测定蛋白质的氨基酸组成时，样品必须经酸水解 一去糖和淀粉 一去脂肪一去核酸一去无机盐等过程后，冉上柱分析。（5）测定必须在 pH55.5

44、、100c条件下进行；衍生化反应进行时间为1015min；生成的紫色物质在 570nm波长下测定，而生成的黄色化合 物在440nm波长下测定。（6）显色反应用西三酮试剂极易被氧化，随着时间延长发色率会降低。故在较长时间测定样过程中应随时采用已知浓度的氨基酸标准溶液上柱测 定以检验其变化情况。（7）要注意氨基酸分析柱柱填料为疏水性高聚物薄壳型离子交换剂，最好 确保流动相pH值在210范围内使用。余者，诸如老化、净化、保养等，请参考 C18柱。5.2.2液相色谱柱的常见故障处理与色谱柱再生1、普通C8及C18反相色谱柱（C8&C 18 Reversed-phase chromatography c

45、olumn）:当色谱柱使用较长时间之后，就可能发生柱压升高、分离度不好、柱效降低、 峰形不好等情况，这时就需要根据故障原因对色谱柱进行清堵与再生， 以延长色 谱柱的使用寿命。具体原因及处理方法如下：（1）筛板堵塞与柱头塌陷：主要现象有柱压严重升高或不稳定、色谱峰拖 尾、色谱峰变宽、色谱峰分叉、秃峰等，需要进行 清堵与弹性复原处理。（此方 法适合于任何类型有相同故障的色谱柱的处理，不同的是溶剂要与相应类型色谱 柱匹配。）主要处理方法如下：一般情况下，将色谱柱反接，不接检测器，用纯水或水-有机相（多用甲醇、乙月青）（95:5）以0.6ml/min流速冲洗约4h一再正向连接，接或不接检测器， 用纯水

46、或水-有机相（多用甲醇、乙月青）（95:5）以0.6ml/min流速冲洗约1h一再 提高流速至1.0ml/min冲洗1h,观察柱压变化。若不凑效，则拧开柱头螺母（色第15页，共20页谱柱进口） ，小心取下筛板，用5%左右的硝酸溶液超声处理20min 左右，再用纯水超声 20min 左右。 用小勺清理掉柱进口污染的部分填料， 再将用乙醇调和后的相应的硅胶装入柱入口（也可用已经报废的同类柱中的填料替代） ，用平面不锈钢小铲压紧填平至略高出柱管口， 但量不宜太多， 否则， 压得太紧柱压会升高， 然后装上清洗过的筛板，注意筛板安装方向必需与原装相同，最后紧固。冲洗与饱和：清堵紧固后，先反向连接色谱柱，

47、不接检测器，用纯水或水-有机相（多用甲醇、乙月青）（95:5）以0.3ml/min流速冲洗约4h-再换成甲醇以 0.5ml/min流速冲洗约2hf冉正向连接色谱柱，接或不接检测器，用纯水或水 - 有机相（多用甲醇、乙月青）（95:5）以0.3ml/min流速冲洗约2h-再换成甲醇以 0.5ml/min流速冲洗约1h然后用甲醇或乙月青以1ml/min流速冲洗约1h以上，冉 根据测试用流动相比例调整水-甲醇（或乙腈）比例，以 1ml/min 流速冲洗约 1h，最后用测试用流动相平衡2h,进样测试即可。 特别说明：如不是特殊情况， 按其他办法可行， 则最好不要反冲色谱柱和拆卸筛板。（ 2）柱效降低：主要特征性现象有柱压基本正常