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1、技术方法名称 逆转录合成 cDNA基本原理 以RNA为模扳，在逆转录酶的作用下合成互补的DNA，即cDNA。与基因组DNA不同，cDNA不包含内含子。图1. 逆转录合成cDNA的原理图用途 1. 从RNA水平对基因的表达进行检测或定量；2. 5 和3 RACE，克隆全长基因。实验材料1. 耗材离心管（规格：0.5 ml）、Tip（规格：0.2 ml）。要求 无RNase和DNase污染。处理方法 一般来说，未开封的进口离心管或Tip均无RNase和DNase污染。但为了慎重起见，需要重新处理。处理程序如下：洗涤饭盒、烧杯和量筒，使之干净 干烤，250 4h，或180 8h以上。干烤时，量筒和烧
2、杯口均需要用铝箔纸 量筒量取无菌去离子水（最好是新鲜制备的水），在烧杯中配制含0.1%DEPC的水溶液，配制时要求混匀，因为DEPC难溶于水 DEPC水溶液加到干烤过的饭盒中，一般需要1.2L，投入适量的离心管和Tip，并尽量使它们均浸泡在水溶液中 37过夜 尽可能地倒去浸泡液，注意不要开盖，以避免RNase的污染 高压蒸气灭菌，15 lbf/in2,（1.034105Pa），20min 烘干，100 2h 置于干净的环境，备用 2. 试剂Oligo(dT)12-18，或随机引物，或基因特异性引物（GSP）10mM dNTP Mix逆转录缓冲液0.1M DTTRNase抑制剂无菌去离子水所有试
3、剂均要求无DNase和RNase污染。基因特异性引物一般由博亚、生工等国内公司合成，PAGE纯化，并用无DNase和RNase的无菌去离子水溶解。Oligo(dT)12-18或随机引物、dNTP Mix、逆转录酶（一般同时带有逆转录缓冲液和DTT）、RNase抑制剂为进口试剂，生产公司有Promega、Invitrogen等。3. 特殊设备自动微量移液器PCR仪实验设计混合适量的RNA、逆转录引物和dNTP，热变性后迅速冷却，以破坏RNA的二级结构。之后加入其它成分，置于合适的温度下反应。反应完成后，热变性，以灭活可能的DNase，水解DNA复合物中的RNA。因单链DNA不如双链DNA稳定，-
4、20下保存的时间一般不超过3个月。严格来说，应该设立阴性对照和阳性对照。阴性对照为省略RNA，其它保持不变。而阳性对照则相对复杂。操作步骤及每步需注意的事项（以SuperScriptTMII RNaseH- Reverse Transcriptase为例）1. 混合逆转录引物、RNA、dNTP1ul oligo(dT)12-18(500ug/ml)，或50-250ng随机引物，或2pmole基因特异性引物1ng to 5ug 总RNA或1-500ng mRNA1ul 10mM dNTP Mix（10mM each dATP, dGTP, dCTP and dTTP at neutral pH）
5、加无DNase和RNase的去离子水补足至12ul2. 热变性热变性，65 5min（目的：破坏RNA的二级结构。一般来说，单链RNA分子能自发形成二级结构，二级结构的比例约为50%）。迅速置于冰上（目的：避免已变性的RNA分子复性）。3. 加入其它反应成分4ul 5First-Strand Buffer2ul 0.1M DTT1ul RNaseOUTTM Recombinat Ribonuclease Inhibitor(40 units/ul)（当RNA量不超过50ng时，RNaseOUTTM是必需的。）4. 逆转录反应 轻轻地上下吸打混匀后，42 2min（目的：避免逆转录引物与RNA非
6、特异性退火） 加入1ul(200 units)SuperScriptTMII RNaseH Reverse Transcriptase，轻轻地上下吸打混匀。若使用随机引物引导逆转录反应，需25孵育10min。 42 50min5. 终止反应70 15min6. 保存100 5min（两个目的：1. 灭活逆转录酶和可能含有的DNase；2. 水解DNA复合物中的RNA）-20保存（单链DNA不如双链DNA稳定，一般不超过3个月）结果观察及分析的原则总cpm掺入cDNA cpm主要的指标有cDNA的产量和质量。cDNA的产量测定：在合成cDNA时，一般掺入-32P-dCTP，pg = 合成DNA的
7、总量。通常合成率不太高，产量最高可达模扳mRNA的50%。cDNA质量的测定：采用放射自显影技术，简单地描述，在合成cDNA时，一般掺入-32P-dCTP（或dATP）。1%琼脂糖凝胶电泳后，进行放射自显影。cDNA长度应为0.7-8kb。实验成功或失败的关键因素1. 分离高质量RNA成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍酸性酚的一步法。Trizol试剂法将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Tr
8、izol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果。另外，分离poly(A)+ RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有mRNA时，poly(A)+ RNA会增加检测的灵敏度。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在
9、水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5min，10,000g离心5min。在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变
10、性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。2. 使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长
11、度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。A A A A A A A AT T T T T T T T ATTTTTTTTAAAAA A A A A A A AT T T T T T T T A A A A A A A AT T T T T T T T 图2. RNaseH产生的障碍RNaseH对第一链cDNA的影响。RNaseH在cDNA合成期间降解RNA:DNA复合体中的RNA。红色箭头代表潜在的酶切位点。SuperScript逆转录酶（MMLV逆转录酶的点突变产物，RNase活性下降，同时酶的稳定性升高），RNaseH- 的MMLV逆转录酶及ThermoScript逆
12、转录酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全长的cDNA。RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。ThermoScript比AMV的灵敏性强得多。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力，尤其是克隆较大的cDNA时。同MMLV相比，SuperScrip显著提高了长RT-PCR产物的产量。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42的温度下进行。3. 选择合适的逆转录引物cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法即三种不同的引物，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。随机引物法是三种方法中特异性最低的。
13、引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250 ng每20 l反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量
14、和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20 l反应体系使用0.5 g oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRN
15、A3最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行RT-PCR，需要设计多于一个反义引物，因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。建议在20 l的第一链合成反应体系中使用1 pmol反义GSP。4. 减少基因组DNA污染RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法，如Trizol Reagent，会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。为了避免产生于基因组DNA的产物，可以在逆转录之前使用扩增级的DNase对RNA进行处理以除去沾染的DNA。将样品在2.0 mM EDTA中65保温10 m
16、in以终止DNase消化。EDTA可以螯合镁离子，防止高温时所发生的依赖于镁离子的RNA水解。5. 提高逆转录保温温度较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用ThermoScript逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时。如果使用GSP，确保引物的Tm值与预
17、计的保温温度相同。不要在高于60时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60前在25保温10 min。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将RNA/引物混合物从65变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2的反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。Reverse TranscriptaseIncubation TemperatureAMV37C-45CM-MLV37CSuperScriptII RT37C-50CThermoScript RT42C-65CRNA在高
18、于65时开始水解，对于1kb的RNA第一链合成温度可以为70，对于1kb的RNA则需要65。表1. 逆转录保温温度Tth热稳定聚合酶在Mg2+存在条件下 作为DNA聚合酶，在Mn2+存在条件下作为RNA聚合酶。它可以在最高65条件下保温。然而，PCR过程中Mn2+的存在会降低忠实性，这使得Tth聚合酶不太适合用于高精确度的扩增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆转录效率较低，这会降低灵敏度，而且，既然单个酶就可以进行逆转录和PCR，那么没有逆转录的对照反应就不能用来将cDNA的扩增产物同污染的基因组DNA的扩增产物区分开来。6. 促进逆转录的添加剂包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反
19、应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入20的甘油或10的DMSO而不影响SuperScript或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20的甘油而不降低活性。为了在SuperScript逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10的甘油并在45保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4，这不足以抑制PCR。7. RNaseH处理在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的
20、全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosis。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。8. 小量RNA检测方法的提高当仅有小量RNA时，RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入Trizol的同时加入无RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无RNase糖元的建议浓度为250g/ml。在使用SuperScript的逆转录反应中加入乙酰化BSA可以增加灵敏度，而且对于小量RNA，减少SuperScript的量并加入40单位的RNaseOut核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在RNA分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用SuperScript进行逆转录反应时加入BSA或RNase抑制剂。