《黑曲霉的分离.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《黑曲霉的分离.docx（5页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、精品文档黑曲霉的分离筛选一、实验简介黑曲霉广泛分布于世界各地的粮食、 植物性产品和土壤中。 黑曲霉的最适温度为 37 ， 黑曲霉对营养要求较低,只要培养基中含有碳源、氮源及磷、 钾、 镁、硫等元素即能生长良好，实验中采用察氏培养基进行培养。黑曲霉的菌落蔓延迅速， 但生长稍局限， 菌丝初为白色， 后变成鲜黄色直至黑色厚绒状， 背面无色或中央略带黄褐色。 顶部形成球形顶囊， 其上全面覆盖一层梗基和一层小梗， 小梗双层褐色， 梗基较短， 上长有成串褐黑色的球状分生孢子。抱子直径2.54.0仙m。分生抱子头球状，直径700800 m,褐黑色。黑曲霉的个体形态和菌落形态都比较特殊， 容易分辨， 可利用平
2、板划线法或稀释涂布法，得到单菌落，并结合显微镜检测，多步鉴定、纯化，得到的纯的菌种。二、实验试剂与材料1 、材料： 黑曲霉孢子悬浮液2 、溶液和试剂： 硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、蔗糖、琼脂、 1mol/L 氢氧化钠溶液、 1mol/L 氯化氢溶液、 75% 乙醇、乙醇乙醚混合液、溴甲酚绿、水。3 、器材和其他用品： 三角瓶、试管、搪瓷杯、培养皿、接种环、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、试管架、载玻片、盖玻片、光学显微镜、恒温培养箱、纱布、牛皮纸、滤纸、 pH 试纸、擦镜纸。三、实验步骤和过程1 、无菌器材及无菌水的准备1.1 培养皿： 洗净的培养皿烘干后， 每组将 5 套培养皿叠在
3、一起， 用报纸卷成一筒，然后进行灭菌。注意，一定要卷紧。1.2 试管： 做合适的棉塞， 每组捆扎 5 支试管， 用报纸包在一起后， 用线绳扎紧，扎成活结，另一头再用皮筋扎好，然后进行灭菌。1.3 三角瓶：在三角瓶瓶口塞一八层纱布，盖上牛皮纸，用线绳扎成活结，然后进行灭菌。注意，装入的培养基不超过三角瓶的 1/2 。上述物品均要用记号笔注明班级、组别、日期。1.4 高压蒸汽灭菌2 、查氏培养基的配制称量-熔化-定容-调pHf分装-加塞包扎标记-灭菌-搁置斜面与倒平板无菌检查培养基配方：硝酸钠3g磷酸氢二钾1g 硫酸镁(MgSO4 H2O)0.5g 氯化钾 0.5g硫酸亚铁 0.01g 蔗糖 30
4、g 琼脂 20g 蒸馏水 1000mlpH5.0-6.02.1 称量：按照培养基配方，依次准确地称取药品，放入搪瓷杯中。2.2 熔化： 量取自来水， 加入所需水量的一部分至上述搪瓷杯中， 用玻璃棒搅拌，待药品溶解后，加入琼脂，倒入余下的水，在电热板上加热熔化。2.3 定容：将加热后的培养基导入量筒中，用自来水进行定容，至 1000ml 。2.4 调 pH ：待培养基稍冷却后，用精密 pH 试纸测量培养基的原始 pH ，若偏酸， 用 1mol/L NaOH 边滴加边搅拌， 使之达到 pH5.0-6.0 。若偏碱， 则用 1mol/LHCl 调节。2.5 分装：用分装装置将培养基装入试管，高度为试
5、管总长的 1/5 ，共 20 支。余下培养基转入三角瓶中，培养基的量为三角瓶容量的 1/3-1/2 。2.6 加塞、包扎、标记：试管加棉花塞， 5 支一捆包扎好，棉塞外加一层报纸防灭菌时冷凝水湿润棉塞，在外用线绳扎成活结，；三角瓶用纱布塞住瓶口，并用牛皮纸的线绳包扎好。用记号笔注明培养基名称、班级、组别、配制日期。2.7 灭菌： 0.1MPa ， 121 ， 20min 高压蒸汽灭菌。2.8 搁置斜面：待已灭菌的试管培养基冷却至50 左右，将试管口端搁置在有合适高度的器具上，使培养基斜面长度不超过试管总长的一半为宜。2.9 倒平板：待三角瓶中培养基冷却至50 左右，倒平板。2.10 无菌检查：
6、 灭菌培养基放入 37 培养箱中一天， 若无细菌污染则说明灭菌彻底。3 、菌种分离纯化3.1 用接种环从黑曲霉孢子悬浮液，接种于小试管斜面中培养（ 5 支）。然后放37 培养箱中培养24 小时。3.2 平板划线： 左手拿平板， 右手拿接种环在火焰上灭菌后沾取菌液或菌苔一环，在平板上划平行线三条，接种环在火焰上灭菌，左手转动平皿约 70 度，用无菌接种环通过第一次划线的末端作为起点作二次划线， 依次作第三次、 第四次划线（平行线划线法）。或将挑取有菌的接种环在平板培养基上作连续划线。培养：合上皿盖，倒置培养皿于 37 培养 24 小时。挑菌落： 挑取单个菌落的菌苔少许， 涂在载玻片上进行显微镜个
7、体形态观察， 结合菌落形态特征综合分析。若不纯，需再用平板划线法继续进行分离纯化。实验分析与检测1、黑曲霉菌落特征抱子呈圆球状，淡灰黑色，数目较多，清晰明显，个体较大。2、菌落计数情况培养平板12345678菌落数182016513179243、菌落形态特征第一天:直径约为5mm的菌落，扁平状，菌丝呈绒毛状，白色。第二天：菌落变大，菌丝基部白色，顶部浅黄色。第三天：菌落更大，菌丝基部浅黄色，顶部形成黑色球状形顶囊（即分生因子）菌丝密集，菌落呈现黑色。4、结果分析黑曲霉生长条件要求低，生长繁殖能力强，在平板上生长后，其他微生物难以生长繁殖，故黑曲霉较易实现扩大培养及分离纯化， 对于利用黑曲霉进行工业 发酵，如柠檬酸发酵具有一定意义。五、实验存在的问题及建议1、在分装培养基时，注意不使培养基沾在瓶口或管壁上端，浸湿棉塞，以免引起杂菌污染；2、接种、分离时，要在无菌环境下进行（靠近火焰），手不可触摸试管口端， 以防烫伤，接种环不要碰触试管口边，防止污染。划线接种时，动作要轻，不要 划破培养基。平板培养微生物时要倒置培养。3、在显微镜观察黑曲霉菌时，使视眼中的黑曲霉菌数维持在10到30个左随意编辑右。