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1、PCR反应的影响因素变性温度与时间:模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度,达不到变性温度就不会产生单链DNA模板,PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全,DNA双链会很快复性,因而减少产量。变性温度太高,又会影响酶的活性。一般情况下可设为94 2030秒,高温时间应尽量缩短,以保持耐热DNA聚合酶的活力,zui高变性温度不宜超过95。退火温度与时间:退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DNA扩增效率下降;温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加。合适的退火温度一般在4568之间。设置特定反应的zui适退火温度,可根
2、据引物的(G+C)%含量进行推测,一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5,退火时间一般为3060秒,足以使引物与模板之间完全结合,长时间退火没有必要。延伸温度与时间:PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间,延伸时间根据所用聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定,如同样扩增2 Kb片段,若使用Taq酶只需1分钟,使用Pfu酶则应设定2分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现,时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。循环次数:可根据模板DNA的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素,设定20-40个循环。循环次数太少,扩增量不足,如果循环次数太多,错配几率会增加
3、,非特异性背景严重。所以,在保证产物得率的前提下,应尽量减少循环次数。酶量:50 L反应体系可用0.5-5 U酶,酶量的选择与模板DNA的量,扩增片段大小等有关,酶量过多易发生非特异性反应,而且可能增加突变的机率,尤其在进行高保真扩增时,应尽量减少酶量,但酶量过少时反应性能下降。模板:模板可以是单链DNA,也可以是双链DNA,质粒DNA的扩增效率略低于线状DNA。模板加量一般不需太多,不超过1 g为宜,因为加量过多可能导致非特异性扩增增加,但是要考虑模板中靶序列的含量。例如,使用基因组为模板扩增单拷贝或低拷贝靶序列,就需要适当加大模板用量。引物:引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸,zui
4、高不宜超过30个核苷酸,zui佳长度为2024个核苷酸,如需插入酶切位点,应在酶切位点5端多加几个碱基,有利于酶切。引物的(G+C)%含量组成应均匀,尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中(G+C)%含量应尽量相似。引物内部应避免形成明显的次级结构,如发夹结构。两个引物之间不应发生互补,特别是在引物3端。如果可能,引物3端zui好富有GC,这样退火后有利于引物3端的延伸。人工合成的引物zui好经过色谱层析纯化或PAGE纯化,以除去未能合成至全长的短链等杂质。引物的终浓度一般为0.1-2 M左右,浓度太高会导致非特异性扩增,太低则扩增产物太少。模板的制备PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA
5、。模板的取材主要依据PCR的扩增对象,可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。标本处理的基本要求是除去杂质,并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌,可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA,经酚、氯仿抽提纯化,再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。反应的控制PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高,常用1.5mmol/L底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制,20200umol/LTaqDNA聚合酶 2.5U(100ul)引物 浓度一般为0.
6、1 0.5umol/L反应温度和循环次数变性温度和时间 95,30s退火温度和时间 低于引物Tm值5 左右,一般在4555延伸温度和时间 72,1min/kb(10kb内)Tm值=4(G+C) +2(A+T)循环次数 :一般为25 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低,可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右,循环数超过30个以后,DNA聚合酶活性逐渐达到饱和,产物的量不再随循环数的增加而增加,出现了所谓的“平台期”。标准的PCR过程分为三步:DNA变性(90-96):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA退火(60-6
7、5):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。延伸(70-75):在Taq酶(在72左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的3端开始以从53端的方向延伸,合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。如图所示:现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60-65间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.
8、07.5,小量分装,-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。试剂对照:在PCR试剂
9、中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增,以监测试剂是否污染。反应条件选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置:基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在9095变性,再迅速冷却至4060,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至7075,在Taq DNA聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100300bp时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94变性,65左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的
10、最主要原因。一般情况下,9394min足以使模板DNA变性,若低于93则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度
11、:Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值-(510)在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec,足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性:7080 150核苷酸/S/酶分子70 60核苷酸/S/酶分子55 24核苷酸/S/酶分子高于90时, DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间,常用温度为72,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的。34kb的靶序列需34min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。