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1、茶叶多酚氧化酶的基因克隆山东农业科学2009,8:912ShandongAculturalSciences茶叶多酚氧化酶的基因克隆骆开明(广东省河源职业技术学院,广东河源517000)摘要:本试验以嫁接可可茶为材料,提取了高质量的茶树基因组DNA,以纯化的DNA为模板,利用Fs和RX引物组合进行PCR扩增,结果扩增出了约1800bp的片段,与预期大小一致.所克隆的PPO基因与其它茶树PPO基因的同源性达到98%,氨基酸序列同源性达到91%,确认为茶叶多酚氧化酶基因.关键词:嫁接可可茶;多酚氧化酶;基因克隆中图分类号:Q785文献标识号:A文章编号:1001-4942(2009)08-0009-
2、04GeneCloneofPolyphenolOxidasesinTeaLUOKai-ming(HeyuanPolytechnicofGuangdongProvince,Heyuan517000,China)AbstractWiththepurifiedDNAextractedfromthegraftingcocoateaastemplate,1800bptargetfragmentwasamplifiedbyPCRusingFSandRXprimercombination.ThehomologybetweentheclonedDNAandthePPODNAofotherteatreesrea
3、chedto98%,whilethatinaminoacidsequencewas91%.SoitwasconfirmedtobetheteaPlPOgene.KeywordsGraftingcocoatea;PPO;Geneclone多酚氧化酶(Polyphenoloxidases,PPO)是自然界分布极广的一种氧化还原酶,也是茶树酶系统中一种重要的酶类.它不仅在生物氧化上起着催化作用,而且在食品加工中,如在制茶时利用酶促褐变促使茶叶品质形成中发挥着重要作用.2.PPO广泛存在于植物和食用菌等生物中,是引起蔬菜,水果,茶叶,烟草等农产品酶促褐变的主要酶类,它不仅影响果蔬及其制品的色泽和风味等
4、感观质量,同时也会造成某些营养物质的破坏,贮藏性能和商业价值的降低,因而PPO的酶促褐变一直是食品领域的研究重点.在食品加工中,只有少数如红茶,可可,咖啡,梅干,葡萄干,枣干,发酵果汁等可以利用酶促褐变来提高其品质,大部分食品中的酶促褐变是需要采取相应措施来控制的-4J.可可茶(CamelliaptilopyhllaChang)是张宏达于1988年在广东龙门县南昆山发现的一类可供饮用的低咖啡碱含量的新茶树资源,其主要特征是内含物中可可碱含量比其它茶种高出许多,可高达6.8%.可可碱在生理和药理方面具有特殊的效果,其急性降压作用缓和,没有兴奋神经作用,有助于睡眠,具有强心作用,可提高机体动态耐力
5、,能抗脂质过氧化,延缓机体衰老,同时能降低胆固醇和血脂,因此可可茶在保健功能上优于含有较多咖啡碱的传统茶叶,市场前景广阔J.本试验以嫁接可可茶为试材,克隆了PPO基因,它对酶制剂的开发利用和提高茶叶加工品质有着重要作用.1材料与方法1.1试验材料供试茶树品种:嫁接可可茶.供试菌株:大肠杆菌DH10B.1.2主要仪器设备低温冷冻离心机;PCR扩增仪;普通电泳系统;紫外分析仪;凝胶成像系统;电击转化仪;电子恒温水浴锅HH6;超净工作台;CHB一1oo型恒温金属浴;Eppendorf5417R离心机.收稿日期:20090429;修回日期:200906?30作者简介:骆开明(1968一),男,广东河源
6、入,讲师,从事遗传工程与环境保护研究.Email:10山东农业科学2009生1.3试验方法1.3.1茶叶DNA提取称取茶叶片约1.2g,加入PVP,研磨成细粉状,加人5ml抽提缓冲液(用时加2%13一巯基乙醇),65%水浴裂解10min,8000r/rain离心8rain,取上清;加入6ml酚一氯仿一异戊醇混合液(25:24:1),8000r/rain离心8rain,取上清;加人6ml氯仿,8000r/rain离心8min,取上清;加人10mol/LLiC1,8000r/rain离心8rain,沉淀为RNA,上清为DNA;吸取上清液DNA至1.5ml离心管中,加人15ml异丙醇,12000r/
7、min离心5rain,取上清,加入70%乙醇0.5ml,12000r/rain离心2rain,所得沉淀即为初提DNA,加人5OlTE溶解.1.3.2DNA的纯化,鉴定及PCR扩增初提的DNA样品加入1/10体积的3mol/LNaAe,再加入2倍体积的无水乙醇;4冷冻离心机中12000r/rain离心15min,弃上清,加入75%乙醇300l清洗,12000r/rain离心5rain,所得沉淀即为纯化DNA,加入500lTE溶解,进行电泳检测和PCR扩增.1.3.3PCR产物纯化与回收在紫外灯下用刀片切含目的DNA条带的凝胶,按1mg凝胶加人1的比例加入NJ缓冲液(载样缓冲液:2%溴酚兰溶液和5
8、0%蔗糖溶液混合而成,用10mol/L的NaOH调成蓝色),把混合物置于65水浴7rain,使凝胶彻底融化;将溶解液加到DNA回收纯化柱上,把柱子装在干净的2rnl收集管内,于2000r/rain离心1min,流出液吸回纯化柱上,于10000r/rain离心1min,用700无水乙醇稀释的SPW洗涤缓冲液(表面等离子波缓冲液)洗涤柱子,于10000r/rnin离心lrnin;再于12000r/rain离心2min;将纯化柱取出置于一新的1.5rnl离心管中,并在吸附柱的中央加人2030干净的TE溶解DNA,于12000r/rnin离心1min,流出滤液重吸回纯化柱.所得DNA收集液于一加保存备
9、用.将回收产物的1l进行电泳,并用kDNA梯度定量和DNAMarkerHI定大小.1.3.4连接与转化(1)连接产物的沉淀:将目的片段与T载体连接,向连接产物中加人3mol/LNaAc1l,ddH203l,无水乙醇25I,12000r/rain,4qC离心15rain;弃上清,加人75%乙醇30l冲洗连接产物,12O00r/min,4离心10rain,所得连接产物沉淀用4IxlddH2O溶解.(2)转化:在2OIxlDH10B感受态细胞中加人2I沉淀后的连接产物,移到冰浴的电击杯中;320V瞬间电击,加入800lSOC液体培养基(SOB培养基加人1/100体积的2mol/L葡萄糖液和1/100
10、体积的2mol/LMg溶液),用1000l移液器移至培养管;37%,180r/rain振荡培养1h;取200l涂含有8IxlIPTG(异丙基硫代半乳糖苷)和35Ixlxga!(5一溴一4一氯一3一吲哚一13一D一半乳糖苷)的蓝白斑筛选平板,室温下至液体被吸收,倒置培养.挑取阳性克隆,用于质粒提取.1.3.5质粒提取在超净台上,用50%甘油5Ol保存200txl菌液两份,吸取1ml剩余菌液于1.5ml离心管中,5000r/rain离心2rain,弃上清,加入200预冷的溶液I(50mol/L葡萄糖;25mmol/LTrisC1,pH8.0;10mmol/LEDTA,pH8.0),旋涡振荡充分悬浮
11、菌体;加人现配的200Ixl溶液(0.2mol/LNaOH,1%SDS)及200l预冷的溶液11I(5mol/LKAc,用冰醋酸调至pH4.8),温和混匀,冰浴15min,12000r/rain室温离心5rain,取上清,加入300氯仿,12000r/rain室温离心5rain;取上清,加入600l预冷的无水乙醇,12000r/rain,4离心5rain;弃上清,用70%乙醇500l洗DNA沉淀,12000r/rain室温离心8rain,用移液器尽可能除去乙醇;用2ORTE(10mg/mlRNaseA)溶解质粒DNA,并在37C金属浴1h消化其中的RNA.1.3.6重组转化子的鉴定(i)重组转
12、化子的酶切鉴定:将抽提得到的质粒DNA用EcoRI酶切鉴定,验证重组子是否有目的片段插入.反应体积20l,其中10Buffer2txl,质粒DNA2Ixl,15U/IxlEcoRI3U,用ddH2O补至20txl.37反应3h后,1%琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果.(2)重组转化子的PCR鉴定:将抽提得到的质粒DNA进行PCR扩增验证重组子是否含有目的片段.反应体系3Ol,各组分如下:10XBuffer3第8期骆开明:茶叶多酚氧化酶的基因克隆l,2mmol/LMg2.4txl,0.2mmol/LdNTP0.6,0.2mmol/L上游引物0.6Ixl,0.2mmol/L下游引物0.6l,205O
13、ng质粒DNA0.2Ixl,5U/ixlTaq酶0.3Ixl,ddH2O加至3Ol.扩增步骤及程序:943min;94C50S,561min,721.5min,30个循环;72oC10min.扩增完毕后,取8l反应产物电泳检测分析PCR结果.2结果与分析2.1提取茶叶DNA的电泳检测电泳检测结果(图1)表明,抽提的嫁接可可茶DNA带形清楚,没有发生明显的降解,可以进行下一步PCR扩增试验.图1基因组DNA电泳图2.2PCR扩增用提取并纯化的DNA为模板,以FS(上游引物,5一ATGGCrlTCCATTCTCCCTCCA一3),RX(下游弓f物,5一AAGATTGAGTrrGATITrAA一3)
14、引物组合进行PCR扩增,结果扩增出了约1800bp片段,与预期大小一致(见图2).4500bp3000bp2000bp图2目的片段PCR电泳图2.3PCR产物纯化回收PCR扩增产物用Kit回收试剂盒回收纯化后溶解于ddHO中,用标准kDNA溶液进行定量检测,结果(图3)表明,1800bp的PPO片段回收浓度介于80100ng/Ixl.图3PCR产物回收定量图2.4转化子的鉴定从筛选平板培养基上挑选出4个白色菌落.分别接人含100il/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中,37培养12h后提取质粒DNA.2.4.1酶切鉴定结果(图4)显示,质粒1,2,4号除切出载体DNA带外,还可切出长度大约分别为
15、800,600,400bp三个片段,加起来总长度与预期的大小一致;两个EcoRI限制性内切酶识别位点;质粒3没有切出条带,是由于质粒DNA不含PPO片段或酶切不完全造成的.表明1,2,4质粒为阳性重组子.图4质粒DNA酶切电泳图2.4.2PCR鉴定挑选1和4两个已初步鉴定出的阳性重组子用特异引物FS/RX引物组合进行PER扩增.结果(图5)显示,用1和4质粒为模板均可扩增出1800bp的目的片段.由酶切和PCR鉴定结果综合确定1和4两个白色单菌落是阳性克隆子.珊船站斡弹一冀ppp12山东农业科学2009生4Sbp3000bp2000bp1200bp800bp500bp图5质粒DNA的PCR鉴定
16、3讨论与结论多酚氧化酶是一类以多酚物质为底物的氧化还原酶,这些酶都具有与铜离子结合的特征区域A,B,属于铜金属酶.多酚氧化酶基因是催化酚氧化的关键酶基因.茶树多酚氧化酶基因与其它植物中的多酚氧化酶基因有较高的相似性.本试验从嫁接可可茶中克隆了多酚氧化酶基因全长,包括1800个核苷酸碱基,编码599个氨基酸,其中有N一端导肽,C一端疏水区和保守结构域A,B-6J,将克隆的PPO基因序列在NCBI上用BLAST进行序列比对分析,表明从嫁接可可茶中克隆的PPO基因与其它茶树多酚氧化酶基因具有较高的同源性,核苷酸水平同源性达到98%以上,在氨基酸水平上也超过了9l%.目前茶树基因组DNA的提取一般采用
17、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法SDS一异丙醇法以及DNA提取试剂盒法.朱旗等(1994)对SDS法作了改进,在用液氮研磨时加人不溶性PVP,结果明显提高了所提茶树基因组DNA的纯度且并不影响DNA的质量.这可能是因为不溶性PVP及时吸附了茶多酚而液氮营造了一个低温环境J.黄建安等(2003).对CTAB,SDS常规法,区室法等DNA提取方法进行比较,也发现PVP与B一巯基乙醇或Na:S:O协同使用抗氧化多酚的效果很好.张智俊等(2003)提出了同时提取油茶中DNA和RNA的简便方法,能有效去除茶叶中酚类和多糖等次生物质的影响,所得DNA和HNA纯度高,完整性好,可用于进一步的DNA分析.本
18、试验采用抽提液中添加2%PYP和2%B一巯基乙醇游离出酚类以去除酚类的影响及2%CTAB的抽提缓冲液和高浓度LiC1,NaCI和异丙醇沉淀处理分离多糖和核酸.从嫁接可可茶中成功克隆了多酚氧化酶基因,此法适用于茶叶相关功能基因的克隆.参考文献:1胡耀武.浅析茶多酚氧化酶研究的几个问题J.福建茶叶,1997,2:2022,44.2吴红酶,萧慧,刘刚,等.多酚氧化酶的研究进展J.茶叶通报,2004,26(2):6264.3彭世清.植物多酚氧化酶的研究进展J.热带农业科学,2000,3:61.4张莉,陈乃富.多酚氧化酶的酶学性质及其应用研究J.安徽农学通报,2006,12(12):29,34.5叶创兴
19、,郑新强,袁长春,等.无咖啡因茶树新资源可可茶研究综述J.广东农业科学,2001,2:1215.6谢春艳,宾金华,陈兆平,等.多酚氧化酶及其生理功能J.生物学通报,1999c,34(6):ll一13.7朱旗,任春梅,洪亚辉,等.茶树叶片DNA提取纯化与检测J.湖南农业大学,1994,20(2):ll4一ll7.8陈亮,陈大明,高其康,等.茶树基因组DNA的提取与鉴定J.茶叶科学,1997,17(2):177181.9罗军武,沈程文.茶树基因组DNA提取纯化技术研究J.茶叶通讯,2002,4:2O一24.1oJ黄建安,黄意欢.茶树基因组DNA的高效提取方法tJ.湖南农业大学,2003,29(5):332.1I张智俊,谭晓风,陈永忠.同时提取油茶中DNA和RNA的简便方法J.生物技术,2003,13(3):2324.