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1、达格列净通过抑制血清/糖皮质激素调节激酶 1 逆转 Th17/Tregs失衡延缓糖尿病肾脏疾病进展糖尿病肾脏疾病(Diabetic Kidney Disease,DKD)是糖尿病最常见的慢性并发症之一,也是导致终末期肾病的最主要原因之一。目前关于糖尿病肾脏疾病发 生发展机制并不是完全清楚。有研究表明,T 细胞免疫在糖尿病肾脏疾病发生发展过程中起到重要作用,而其中辅助性 T 细胞 17(Helper T cell 17,Th17)与调节性 T 细胞(Regulatory Tcell,Tregs)比例的失衡能促进糖尿病肾脏疾病的发生及发展。血清/糖皮质激素调节激酶 1(Serum/Glucocor
2、ticoid Regulated Kinase 1,SGK1)是一种广泛表达于各个组织器官的丝氨酸-苏氨酸激酶,其可被高盐环境所激活,有研究表明活化的血清/糖皮质激素调节激酶 1 能促进初始 T 细胞向辅助性 T 细胞 17 分化,进而导致组织中辅助性 T 细胞 17 与调节性 T 细胞比例的失衡,这与 Foxol/IL-23R 通 路激活相关。钠离子/葡萄糖同向转运体 2(Sodium/Glucose cotransporter 2,SGLT2)是一类广泛表达于肾小管上皮细胞的转运蛋白,高糖环境下,肾小管上皮细胞中钠离子/葡萄糖同向转运体 2 表达明显升高,促进了肾小管上皮细胞对钠离子及葡萄
3、糖的重吸收,进而导致肾脏组织钠离子浓度升高,形成局部高盐环境。因此,本研究旨在探讨钠离子/葡萄糖同向转运体 2 是否能通过增加肾小管上皮细胞重吸收钠离子,激活血清/糖皮质激素调节激酶 1 进而引起肾组织中辅助性 T 细胞 17 与调节性 T 细胞比例的失衡,最终促进糖尿病肾脏疾病进展。并进一步探讨达格列净对上诉机制的抑制作用。方法 1、动物实验实验使用 8 周龄 db/db 小鼠(n=18)及 8 周龄 C57L6 野生型小鼠(n=6)。将 db/db 小鼠随机均分为糖尿病对照组(DM 组)、糖尿病+达格列净组(Dap组)和糖尿病+伏格列波糖组(Vog 组),分别每天以生理盐水(1mg/kgd
4、)、达格列净(1 mg/kgd)和伏格列波糖(0.6 mg/kgd)进行灌胃。C57L6 小鼠作为空白对 照组,每天以生理盐水(1 mg/kgd)灌胃。药物干预前、干预后第 6 和 12 周收集 24 h 尿。所有小鼠于 22 周龄时处死, 处死前眼眶采血收集外周血。2.肾组织病理与免疫组化小鼠处死后取其肾脏组织,使用 4%多聚甲醛固定24 小时后用石蜡包埋、切片机切片(3um)。病理检验方面,组织切片使用 PAS 染 色及 Masson 染色处理后显微镜下拍照。免疫组化方面,组织切片经兔-抗人 SGLT2 多克隆抗体或兔-抗人 SGK1 多克隆抗体孵育过夜后,使用辣根过氧化酶标记的兔二抗孵育
5、,最后用苏木紫染色,显微镜下拍照。3.ELISA 小鼠尿液样本经过 3000r/分钟离心 10 分钟后取上清液,分别使用小鼠肌酐 ELISA 检测试剂盒及小鼠尿蛋白 ELISA 检测试剂盒检测小鼠尿液中 肌酐及尿蛋白含量。小鼠血液样本经 2%EDTA 抗凝处理后,于 4 3000r/分钟离心 10 分钟,取上清液,分别使用 IL-17 及 IL-10 ELISA 检测试剂盒检测上清液中 IL-17 及 IL-10含量。操作按说明书进行,Bio-Rad iMark 酶标仪测量各孔的吸光度(OD 值)。4.外周血和肾组织流式细胞术在单细胞悬液中加适量的 IL-17A 抗体,室温避光孵育 20 分钟
6、后加入 2ml 细胞染色缓冲液,250g 离心 5 分钟,去上清。加入 1ml1ROR t Fix/Perm buffer 重悬细胞室温避光孵育 20 分钟,250g 离心 5 分钟, 去上清。加入 2ml 细胞染色缓冲液,250g 离心 5 分钟,去上清。加入 1ml 1 ROR tPermbuffer,250g 离心 5 分钟,去上清后加入 1ml 1 XROR t Perm buffer 重悬细胞,室温避光孵肓 15 分钟,离心去上清,再将细胞重悬在 100ul 的 1ROR t Perm buffer 中。最后加入 ROR t 抗体,室温避光孵育 30 分钟。加入 2ml 细胞染色缓冲
7、 液,1200r/分钟离心 5 分钟,去上清。加入 500ul 细胞染色缓冲液,Millpore Guava EasyCyte 流式细胞仪检测。Tregs 细胞评估采取了同样的方案,所使用的抗体为 CD4 抗体、FoxP3 抗体。5.Th17 细胞分选制备小鼠肾组织细胞悬液,进行计数与测定细胞活力。选取适宜细胞密度,采用免疫磁珠法分离纯化小鼠 CD4+CD62L+初始 T 细胞,筛选得到 阳性初始 T 细胞。收集细胞,用 1ml 11X FOXP3 Fix/Perm buffer 重悬细胞,混匀,室温避光孵育 20 分钟,1000r/分钟离心 5 分钟,弃上清。加入 1ml cell stai
8、ning buffer,1000r/分钟离心 5 分钟,弃上清。加入 1ml 1 FOXP3 Perm buffer, 混匀,1000r/ 分钟离心 5 分钟,弃上清。用 1ml 1 FOXP3 Perm buffer 重悬细胞,室温避光孵肓 15 分钟,1000r/分钟离心 5 分钟,弃上清,再将细胞重悬在 100ul 的 11X FOXP3 Perm buffer 中。加入 ROR t 和 IL-17 抗体,室温避光孵育 30 分钟,1000r/分钟离心 5 分钟, 弃上清。200uL PBS 重悬细胞,流式鉴定 Th17 细胞比例。6.Western Blot 使用 RIPA 提取 Th
9、17 总蛋白,并用 BCA 法测定样品蛋白浓度。制备 10%SDS-PAGE,将变性后的样品蛋白(20ug)进行电泳分离,然后转到 PVDF 膜 上。用含 5%脱脂奶粉的 TBST 液封闭 PVDF 膜,与一抗(抗-SGK1、抗-p-Foxo1 和抗IL-23r)在 4摇床上孵育过夜。接下来将 PVDF 膜与 HRP 标记的二抗孵育 1 小时。在暗房内用 ECL 发光液孵育膜 5 分钟,最后拍照并用凝胶图像分析系统分析结果。所有 Western Blots 结果至少重复 3 次,使用 ImageJ 软件进行半定量分析。7.统计分析本论文所有统计数据结果采用平均数标准差表示。单向方差分析用于多样
10、本方差齐性比较,SNK 法及 Dunnett 法用于多样本间两两比较。统计分析使用的是 IBM SPSS Statistics 22, 以 P<0.05 为显著性差异。结果 1.达格列净对 db/db 小鼠蛋白尿及肾脏纤维化的影响的研究与野生型小鼠相比,db/db 小鼠尿蛋白/肌酐比值明显升高,与此同时,其肾脏纤维化程度亦更 显严重。而达格列净能降低 db/db 小鼠尿蛋白/肌酐比值,同时改善肾脏纤维化。2.达格列净对 db/db 小鼠 Th17/Tregs 失衡的影响的研究与野生型小鼠相比,db/db小鼠血液及肾脏中 Th17 数目明显升高,而 Tregs 数目明显下降,两者之间存在失
11、 衡。使用达格列净干预后,db/db 小鼠 Th17/Tregs 失衡得到纠正,肾脏纤维化亦得到改善。3.达格列净对 db/db 小鼠肾脏 T 细胞分化的研究与野生型小鼠相比,db/db 小鼠肾脏 Th17 中,SGK1、p-FOXO1、IL-23R 表达量明显增多,这提示在 db/db 小鼠肾内 Th17 细胞分化活跃。而使用达格列净干预后,SGK1、p-FOXO1、IL-23R 表达均受抑制。结论 1.达格列净能改善糖尿病肾脏纤维化病变 2.达格列净扭转糖尿病肾脏疾病小鼠血液和肾脏 Th17/Tregs 失衡 3.达格列净能抑制糖尿病肾脏疾病小鼠肾脏 Th17 细胞 SGK1/p-FOXO1/IL-23R 通路激活,从而抑制 Th17 细胞分化。