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1、2020 年高二生物选修一专题五血红蛋白的提取和分离知识点总结测试无答案专题五血红蛋白的提取和分离【知识框架】1. 分离不同种类蛋白质可以利用蛋白质各种特性的差异，如分子的_、 所带电荷的 _、_、_和对其他分子的 _等。凝胶色谱法也称做 ，是根据分离蛋白质的有效方法；电泳是指带电粒子在 _的作用下发生 _的过程，许多重要 的生物大分子，如、等都具有，在 下，这些基团会带上，在电场的作用下，这些带电分子会 向着与其所带电荷的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异以及 _ 、 的不同，使带电粒子产生不同的 _ ， 从 而 实 现 样 品 中 各 种 分 子 的 分 离 。 常 用 的
2、电 泳 法 有 _电泳和_电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶 电泳中的迁移率取决于以及等因素。在测蛋白质分子量（纯度鉴定）时通常使用_电泳。2.当相对分子质量不同的蛋白质通过琼脂凝胶层析时，相对分子质量 的蛋 白质容易进入凝胶内部，路程较 ，移动速度 ；而相对分子质量大的蛋白 质无法进入凝胶内部，路程较 ，移动速度 ，导致相对分子质量小的 流 出，相对分子质量大的 流出，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。3.蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、粗分离、 （1）样品（哺乳动物的血液）处理和粗分离和 。样 品 处 理 和 粗 分 离 的 过 程 为 ： 。红细胞的洗涤：目的：去除；方法： 离心。采集
3、血样前，盛血容器中需预先加入_作为_， 以防止_ 。 采 血 后 应 及 时 分 离 _ 和 _ ， 分 离 方 法 采 用 _（500r/min 离心 10min），分离后，去除_层透明的黄色血浆， 将_层_色红细胞倒入烧杯，加入 _倍体积的_，缓慢搅拌 10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次以上，直至_， 表明红细胞已洗涤干净。洗涤红细胞时，洗涤次数过少，无法将_全部 除去，如果血液样品离心后分层不明显，可能原因是；离心速度过_ 和时间过_，会使 白细胞和淋巴细胞一同沉淀，得不到的红细胞，影1 / 52020 年高二生物选修一专题五血红蛋白的提取和分离知识点总结测试无答案响后续提取的
4、血红蛋白的。2 血红蛋白的释放：将已洗涤干净的红细胞倒入烧杯，加到原血液的 体积，使红细胞 _ ，再加 40% 体积的，使 _ 溶解，置于 _搅拌器上充分搅拌 10 分钟（加速细胞破裂）, 红细胞破裂释放出血红蛋 白。3 分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液转移到离心管内，以 2000r/min 的速 度进行高速离心 10 min ，离心管中的溶液从上往下分为 4 层:第 1 层（最上层）：的_层第 2 层（中上层）：的沉淀层，色薄层固体第 3 层（中下层）：的水溶液层，的液体第 4 层（最下层）：其它杂质的沉淀层将试管中的液体用过滤、除去，于中 静置片刻后，分离出下层的。粗分离：即。将装有血红
5、蛋白溶液的透析袋放入 pH 为 7.0 的 _ 中 ， 透 析 12h ， 透 析 的 原 理 是 _ _ ， 透析的目的是_ _ 。（2）血红蛋白的纯化凝胶色谱法(层析)1 制作色谱柱：柱体是长 40cm、内径 1.6cm 的玻璃管，柱顶部插入安装了 _的橡皮塞，柱底部插入安装了 _（带头部）的橡皮塞（橡皮塞上 部切成锅底状凹穴），在橡皮塞中安装移液管时，移液管上部 _（必需/不 能）超过橡皮塞凹穴底面，凹穴上覆盖尼龙网，再用尼龙纱将橡皮塞上部包好插 入柱体的下端，移液管头部作为出口部位，连接细尼龙管，用螺旋夹控制尼龙管 的打开与关闭。2 装填凝胶色谱柱：商品凝胶使用前直接放在中膨胀，并用
6、将加入洗脱液的 _加热至接近沸腾，这种方法既加速凝胶膨胀， 又除去凝胶中可能带有的 _和排除凝胶颗粒内的 _。因为干的凝胶 和用缓冲液（洗脱液）平衡好的凝胶的体积差别 _（不大/很大），所以装 柱 前 需 要 根 据 色 谱 柱 的 内 体 积 计 算 。 交 联 葡 聚 糖 凝 胶 （SephadexG-75）的“G”表示凝胶的_、_及_，“75”表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水_g。 凝胶装填色谱柱时，色谱柱下端连接的尼龙管应 _（打开/关闭），将配制 好的凝胶悬浮液_（一次性/分多次）缓慢倒入色谱柱内，期间_（可2 / 52020 年高二生物选修一专题五血红蛋白的提取和分离知识点总
7、结测试无答案以/不能）轻微抖动色谱柱，使凝胶装填均匀，凝胶色谱柱内不得有存 在，否则会搅乱洗脱液中蛋白质的，降低。一旦发现凝 胶柱内有气泡，必需 _ 。凝胶装填完毕，立即连接盛有 _ （pH 为 7.0）的洗脱瓶，在 50cm 高的操作压下充分洗涤平衡，使凝胶装填紧密。样品的加入和洗脱：加样前，打开色谱柱下端的流出口，让色谱柱内凝 胶面上的缓冲液缓慢下降，当缓冲液缓慢下降到_时关闭出口， 然后按照下图顺序加样，最后连接装有缓冲液的洗脱瓶进行洗脱，待红色 蛋白液接近色谱柱底部时，用试管收集流出液，每试管_mL。如果凝胶色谱柱 装填成功、分离操作正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带_、_、 _地随
8、着洗脱液缓慢流出，反之，如果凝胶色谱柱的装填不好，红色区带 _、_、_，分离效果不好。通过凝胶色谱 (层析)除去透 析后的血红蛋白溶液中的。（3）纯度鉴定：判断的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的 鉴定。在鉴定的方法中，使用最多的是。十二烷基硫酸 钠（SDS）能与各种蛋白质形成“蛋白质SDS 复合体”， SDS 所带负电荷的量 大大超过蛋白质分子的电荷量，掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，电泳时，蛋 白质的迁移速率完全取决于_，蛋白质由点样孔向_极迁移，3 / 52020 年高二生物选修一专题五血红蛋白的提取和分离知识点总结测试无答案点样孔在_极一端；SDS 能使蛋白质发生完全变性，多肽链
9、蛋白质解聚成单 条肽链，因此， SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的结果是 _ 的分子量。 将纯化的血红蛋白样品与若干已知分子量的标准蛋白分别加入到电泳装置上槽的点样孔中，电泳后，观察血红蛋白条带与标注蛋白条带的位置，可确定提取的蛋白质的分子量。图甲的上、下槽中加入_，上、下槽之间是_。比较图乙条带蛋白质的分子量大小：_。4血红蛋白的提取和分离常见试剂及其作用：柠檬酸钠： ； 生理盐水： ；蒸馏水：使红 细胞_；40%的甲苯溶液： ；磷酸缓冲溶液：维持 pH 稳定，使血 红蛋白的_不受破坏。5缓冲溶液能够在一定的范围内，能抵制外来 _对溶液_的影响， 维持基本不变，缓冲溶液通常由种缓冲剂溶解于水中配
10、制而成。调 节缓冲剂的就可以制得使用的缓冲液。【核心要点】1.凝胶色谱层析法蛋白质项目凝胶内部运动方式经过路程洗脱次序2.电泳法原理相对分子质量大不能进入垂直向下较短先流出相对分子质量小能进入垂直向下和无规则扩散运动较长后流出在一定 pH 下，蛋白质分子的某些基团解离后带上正电或负电。在电场的 作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。4 / 52020 年高二生物选修一专题五血红蛋白的提取和分离知识点总结测试无答案由于待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的 不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3比较琼脂糖凝胶电泳和 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(1) 从载体上看，利用琼脂糖凝胶作为载体的是琼脂糖凝胶电泳，利用聚丙 烯酰胺凝胶作为载体的是 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。(2) 从依据上看，利用了分子带电性质差异和分子大小的是琼脂糖凝胶电泳， 仅利用了分子大小的是 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。(3) 从优点上看，琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需处理， 电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了净电荷对 迁移率的影响，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。4实验操作程序5 / 5