免疫组化实验步骤.doc

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1、免疫组化操作步骤一、实验原理与意义 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 （一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试 剂1. PBS缓冲液（ph7.27.4）：NaC137mmol/L，KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmo

2、l/L, KH2PO4 1.4mmol/L.20.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。30.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。6. 3

3、%甲醇H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.09.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8TBS/PBS PH9.09.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60恒温箱中烘烤20分钟。a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复 在沸水中加入EDTA(

4、ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 b 沸热修复 电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95左右，放入组织芯片加热10-15分钟。 c 微波炉加热 在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原： Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit

5、.c-myc.E-cadherin. ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等B 酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等3、免疫组化染色SP法（1） 脱蜡、水化 （2）PBS洗2-3次各5分钟 （3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在T

6、MA上，室温静置10分钟 （4）PBS洗2-3次各5分钟 （5）抗原修复（6）PBS洗2-3次各5分钟 （7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体（8）滴加抗50l,室温静置1小时或4过夜或371小时（9）4过夜后需在37复温45分钟（10）PBS洗3次每次2分钟（11）滴加抗45-50l,室温静置或371小时（12）抗中可加入0.05%的 tween-20.（13）PBS洗3次各5分钟（14）DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度 （15）PBS或自来水冲洗10分钟 （16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化（17）自来水冲洗10-15分钟 （18）脱水、透明、封片、镜检。

7、4、SABC法（1） 脱蜡、水化 （2）PBS洗2次各5分钟 （3）用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次（4）抗原修复（5） PBS洗5分钟 （6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体（7）滴加抗50l,室温静置1小时或4过夜或371小时（8）PBS洗3次各2分钟（9）滴加生物素化抗，20-37 20分钟（10）PBS洗3次各2分钟 （11）滴加试剂SABC 20-30 20分钟（12） PBS洗4次各5分钟 （13） DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色（14）脱水、透明、封片、镜检。 免疫组化问题解答1、染色过强原因 解决方法a 抗体浓度

8、过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜b 孵育温度过高超过37度 一般在室温20-28度c DAB显色时间过长或浓度过高 显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准 2、非特异性背景染色原因 解决方法a 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3次每次5分钟b 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长c 组织中含内原性生物素 正常非免疫动物血清再封闭d 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间3、染色弱原因 解决方法a 抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不能少 于60分钟b 试剂超过有效使用时间 应更换试剂c 操作中添加试剂时缓

9、冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释 （应防止切片干燥）d 室温太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜e 蛋白封闭过度 封闭不要超过12分钟4、染色阴性原因 解决方法a 操作步骤错误 应重试 设阳性对照b 组织中无抗原 设阳性对照以验证试验结果c 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗二抗种属无误 三步法（SP系列），实验步骤使用说明：SP9001（兔）适用于兔来源的一抗SP9002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗SP9003 （山羊） 适用于山羊来源的一抗SP9000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗3.0ml- 价格 ￥230.0

10、0 / 6.0ml- 价格 ￥380.00 / 18ml- 价格 ￥1080.00试剂盒规格及贮存条件规格：3ml（50片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)贮存条件：本试剂盒宜4保存，稳定期1 年一试剂盒内容试剂1 封闭用非免疫的驴血清工作液（含10%驴血清） 即用型 试剂2 生物素化二抗（驴抗兔/鼠/山羊） 即用型 试剂3 链酶卵白素-碱磷酶轭合物 即用型 试剂3 过氧化物酶标记链酶卵白素 即用型 实验步骤简介：1.细胞爬片：冷丙酮或4%的多聚甲醛固定的细胞爬片，置0.1mol PBS 室温10分钟复水。2.修复：滴加复合消化液（0.125胰蛋白酶% +0.1胃蛋白酶%+0.0

11、1 EDTA% ）（ 0.1molPBS配制）4度30-40分钟 0.1mol PBS 洗三次，每次一分钟3.血清封闭：（试剂1）室温 10分钟，倾去。4.一抗：37 1小时或4度过夜5.0.1mol PBS 洗三次-每次三分钟6.相应的生物素化二抗（试剂2）37 30-40分钟7.0.1mol PBS 洗三次-每次三分钟8.链酶卵白素-碱磷酶轭合物或过氧化物酶标记链酶卵白素（试剂3） 37 40分钟9，NBT/BCIP或DAB显色，切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。 灏洋生物 15:14:49名称 ：connexi

12、n 43 产品编号 ：CM7269价格/规格：0.1ml/20ug 技术指标 ：小鼠抗人，大鼠，小鼠 单克隆抗体 Ig分类：IgG2a 适用组织 ：冰冻/石蜡 阳性部位：细胞浆 组织处理：0.1mol枸橼酸缓冲夜-热修复15分钟（95度）产品说明 ：产地: Cellscience二步法（无生物素PV6000系列），实验步骤使用说明：试剂盒组成 试剂A: 3% H2O2 试剂B: Polymerized HRP-Anti Mouse或Rabbit IgG 3.0ml/6.0ml/18ml（根据一抗宿主而定）PV6001（兔）适用于兔来源的一抗PV6002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗PV6000

13、(通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗3.0ml- 价格 ￥300.00 / 6.0ml- 价格 ￥580.00 / 18ml- 价格 ￥1780.00试剂盒规格及贮存条件规格：3ml（50片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)贮存条件：本试剂盒宜4保存，稳定期1 年免疫组化染色步骤1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗三次，每次3分钟（3x3）。2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。3. 如果有必要，每张切片加1滴（试剂A）室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3x3。4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50l的第一抗体(

14、用户自选)，室温下孵育60分钟或4过夜，建议参见每种抗体的说明书。5. PBS冲洗3x5。除去PBS液，每张切片加1滴或50l酶二抗聚合物(试剂B)，室温下孵育40分钟或37度孵育30分钟或4度过夜。PBS冲洗3x3。6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50l新鲜配制的DAB或AEC溶液（详见DAB或AEC使用说明书），显微镜下观察3-5分钟（DAB）或10分钟（AEC）。7. 自来水冲洗，苏木素复染，若有必要，可用0.1%HCl分化，自来水冲洗，PBS返蓝。8. 如果用DAB显色，则切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂

15、。封片。 灏洋生物 15:15:15名称 ：connexin 43 产品编号 ：CM7269价格/规格：0.1ml/20ug 技术指标 ：小鼠抗人，大鼠，小鼠 单克隆抗体 Ig分类：IgG2a 适用组织 ：冰冻/石蜡 阳性部位：细胞浆 组织处理：0.1mol枸橼酸缓冲夜-热修复15分钟（95度）产品说明 ：产地: Cellscience二步法（无生物素PV6000系列），实验步骤使用说明：试剂盒组成 试剂A: 3% H2O2 试剂B: Polymerized HRP-Anti Mouse或Rabbit IgG 3.0ml/6.0ml/18ml（根据一抗宿主而定）PV6001（兔）适用于兔来源的

16、一抗PV6002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗PV6000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗3.0ml- 价格 ￥300.00 / 6.0ml- 价格 ￥580.00 / 18ml- 价格 ￥1780.00试剂盒规格及贮存条件规格：3ml（50片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)贮存条件：本试剂盒宜4保存，稳定期1 年免疫组化染色步骤1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗三次，每次3分钟（3x3）。2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。3. 如果有必要，每张切片加1滴（试剂A）室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3x

17、3。4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50l的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟或4过夜，建议参见每种抗体的说明书。5. PBS冲洗3x5。除去PBS液，每张切片加1滴或50l酶二抗聚合物(试剂B)，室温下孵育40分钟或37度孵育30分钟或4度过夜。PBS冲洗3x3。6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50l新鲜配制的DAB或AEC溶液（详见DAB或AEC使用说明书），显微镜下观察3-5分钟（DAB）或10分钟（AEC）。7. 自来水冲洗，苏木素复染，若有必要，可用0.1%HCl分化，自来水冲洗，PBS返蓝。8. 如果用DAB显色，则切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。封片。