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1、木聚糖酶作用机理及区分木聚糖内外切酶测定方法探讨 2007-08-01 13:01:27作者：汤海鸥来源：挑战部文字大小：【大】【中】【小】近年来，木聚糖酶以其特有降解阿拉伯木聚糖，消除阿拉伯木聚糖对动物的抗营养作用，已成为一种在养殖业中广泛应用的酶制剂。特别是基因工程菌株性木聚糖酶以其稳定性好，降解效率高等特点引起了人们的广泛关注。然而木聚糖酶是降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称，要想很好的应用木聚糖酶制剂产品，必须对木聚糖酶的作用机理有较深的了解。同时，在实际生产应用中木聚糖内切酶和外切酶的协同作用对木聚糖降解至关重要，但对于如何应用检测方法去区分木聚糖内外切酶的性质却很少关注。由此，本文首
2、先从分子角度对木聚糖酶的作用机理进行了论述，然后对区分木聚糖酶系中内切酶和外切酶的检测方法进行了探讨，意欲对木聚糖酶制剂产品在生产上更好的应用提供帮助。1. 木聚糖酶作用机理木聚糖是由1,4或1,3糖苷键连接的一种杂合多聚分子。主链由多个吡喃木糖基通过木糖苷键相连，侧链上连着多种不同大小的短的取代基,主要有乙酰基、4-甲基-D-葡糖醛酸残基、L-阿拉伯糖残基等。这些侧链与植物细胞中其它几种结构性多糖(如木质素、纤维素、果胶、葡聚糖等)以共价或非共价键连接,组成植物细胞重要的结构细胞壁。木聚糖主要存在于植物细胞的次生壁中,处于木质素及其它多聚糖之间,起着连接作用。也正由于这些侧链的不同,使得木聚
3、糖的结构变化范围很大,从仅由-1,4-糖苷键连接的多聚木糖线性分子到高度分枝的异质多糖。因此，要使木聚糖完全降解则需要多种水解酶的协同作用，这其中包括主链水解酶D1,4内切木聚糖酶、D1,4外切木糖苷酶和侧链水解酶aL阿拉伯呋喃糖苷酶、a葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶等。木聚糖降解时，起主要作用的酶是D1,4内切木聚糖酶和D1,4外切木糖苷酶。D1,4内切木聚糖酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的- 1，4木糖苷键,其主要水解产物为低聚木糖、木寡糖、木二糖等；D1,4外切木糖苷酶通过水解低聚木糖、木寡糖等的非还原性末端来催化释放木糖残基。另外, 参与彻底降解木聚糖的还有aL阿拉伯呋喃糖苷酶、-葡萄
4、糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶及能降解木聚糖上阿拉伯糖侧链残基与酚酸(如阿魏酸或香豆酸)形成的酯键酚酸酯酶等侧链水解酶，它们作用于木糖与侧链取代基之间的糖苷键，协同主链水解酶的作用最终将木聚糖转化为它的组成单糖。2. 区分木聚糖内外切酶测定方法广义上的木聚糖酶是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，因此常规木聚糖酶的检测方法仅是以酶降解木聚糖产生还原糖的量为标准来确定酶活单位，还原糖一般都以木糖等量。而实际上还原糖木糖是各种木聚糖水解酶协同作用的最终产物，这其中主要是内切木聚糖酶、外切木糖苷酶，但从常规检测方法上很难判断木聚糖酶的性质是内切还是外切。所以要想应用检测方法去区别木聚糖酶的性质
5、是内切还是外切必须从内切和外切性质本身入手寻找方法，根据木聚糖酶酶解的特性本文总结出以下几种方法。2.1 间接测定法2.1.1 酶解产物薄层层析对照法（TLC法）标准品：木糖、木二糖、木三糖、木四糖；薄层板：硅胶G薄板；展层剂：正丁醇:吡啶:蒸馏水= 6 : 4 : 3；显色剂：邻苯二甲酸苯胺溶液；酶解产物的制备：在一定温度和pH条件下，应用木聚糖酶将木聚糖降解成寡糖或单糖。实验方法分析：木聚糖类半纤维素酶解时一般由木聚糖酶从主链内部先作用于长链木聚糖的糖苷键上，将木聚糖随机切成不同链长的低聚木糖，再由-木糖苷酶作用于低聚木糖的末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木糖，将这些短链低聚木糖降解成木糖
6、。而在薄层层析板上木糖的展距高于木二糖及二糖以上的低聚糖。由此，若将酶解产物在薄层板上展开时，如果酶制剂是内切酶则展距最多只能展到和木二糖标准品展距一样的高度，如果是外切酶则展距能达到木糖标准品展距的高度。2.1.2 酶解产物高效液相色谱对照法（HPLC法）标准品：木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖；酶解产物的制备：在一定温度和pH条件下，应用木聚糖酶将木聚糖降解成寡糖或单糖。实验方法分析：由“2.1.1”分析可知，若未知酶是内切木聚糖酶则酶解产物组分全部是低聚木糖,没有木糖，若未知酶是外切木糖苷酶则组分酶解产物大部分是木糖（如图2）。2.2 直接测定法2.2.1 D1,4内切木聚糖酶活力测
7、定方法测定原理：通过将染色的小麦阿拉伯木聚糖与内切-木聚糖酶一起孵化，底物被降解为低分子量的染色片段，向反应液中加入甲基化酒精，低分子量的染色片段仍然保留在溶液中，通过离心可将高分子量底物除去，将上清液比色。根据标准曲线计算内切-木聚糖酶活力。测定步骤：取0.5ml底物溶液于玻璃试管中，在40平衡5min；取0.5ml预平衡的酶液加入到底物溶液中，在用旋涡振荡器混合，在40水浴中孵化10min（从加入酶液开始精确计时）；加入2.5ml甲基化酒精(95%v/v)在旋涡振荡器上搅拌10S，以终止反应并沉淀未降解的高分子量底物；将反应液冷却到室温，再混合，然后在3000rpm离心10min；在590
8、nm处测定上清液吸光度，根据标准曲线（以黑曲霉木聚糖酶和Azo-小麦阿拉伯木聚糖(Lot50201)制作）计算酶活性。反应空白：在0.5ml底物溶液中加入2.5ml甲基化酒精(95%v/v)，然后加入0.5ml预平衡的酶液。一般空白在590nm处吸光度不超过0.05。酶活计算：内切-木聚糖酶活力首先参照标准曲线将吸光度转化为mUnits/0.5ml，然后按下列公式计算：U/g=mUnits250（1/1000）Dilution式中：2 从0.5 ml转化为1.0 ml；50 酶提取时缓冲液体积；1/1000 从mUnits转化为Units；Dilution 稀释倍数。酶活定义：在40，pH值4
9、.7条件下，从小麦阿拉伯木聚糖中释放相当于1mol木糖还原糖需要的酶量。2.2.2 D1, 4外切木糖苷酶酶活力测定在25m1刻度试管中加入O.1ml适当稀释的酶液和0.5ml用0.05mo1/L柠檬酸缓冲液配制的2.5mmo1/1对硝基苯酚-木糖苷(p NPX)(Sigma公司制造)溶液。放人恒温水浴器中在50下保温30min后立即加人4ml0.25mo1/l的Na2C03溶液终止反应，定容到25ml，充分摇匀后于410nm波长下测定释放的对硝基苯酚的吸光度值A410(每次应做有底物无酶有酶无底物空白实验)。根据对硝基苯酚的标准曲线(用对硝基苯酚的绝对量对A410作图)，找出反应所产生的对硝基苯酚量（扣除空白值)。酶活定义：一个木糖苷酶活力单位为每分钟生成1mol对硝基苯酚所需的酶量。3. 小结综上所述，只有在D1,4内切木聚糖酶和D1,4外切木糖苷酶以及一些木聚糖侧链水解酶共同作用下，木聚糖才能得到充分降解。而对于区别木聚糖内外切酶的测定方法可分为间接测定和直接测定，其中间接测定方法在方法上相对简单易行，直接测定方法虽然有点繁琐但测定结果相对更准确，应用时可根据实际情况采取相应的方法。