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1、1. 新生大鼠海马分散细胞培养模型目标：培养时间=6w步骤：1.培养皿的处理：1）选择培养皿：用35mm孔径的6孔培养板（塑料培养皿，其中放置盖玻片）/96孔培养板？2）每个培养皿中加入0.1g/L的多聚-L-赖氨酸2ml，静止30min。除去溶液，以D-Hanks液浸洗后（10min3次），加入适量培养液，放培养箱内4h后弃液待用。2.神经元的培养：1）取新生SD大鼠，脱颈处死后70%酒精中消毒1min ，将头置于装有无菌冰的培养皿中，去头。2）取出脑，置于解剖液（冰浴）中，剔除脑膜和血管，分离出双侧海马；用解剖液（冰浴）清洗2次3）于解剖液将海马剪碎(1mm3)，移至15ml的离心管中/6
2、cm的培养皿中（待定），加1.25g/L胰酶2ml。放入37培养箱中消化后（时间待定），当消化液浑浊，用血清/含血清的DEME终止胰酶反应（冰浴）。4）上述混合液离心（时间、转速待定），去上清。5）沉淀加入加接种液（1-1.5ml）+DNA酶（冰浴）。10次吹打过后，静止2分钟，取细胞悬液置于另一离心管中（冰浴）。沉淀物再加1-1.5ml新鲜培养液，重复刚才的步骤，轻柔吹打，再静止2分钟，转移上层的细胞悬液至离心管中（冰浴）共重复三次3次，将剩余的沉积物弃去。6）细胞悬液血球计数器计数细胞总数，台盼蓝染色计数活细胞数。7）将细胞悬液以接种液稀释至5105cell/ml接种。8）一段时间后全量换
3、液为无血清DEME（时间待定）9）于培养一段时间后（待定），在培养液中加入阿糖胞苷（终浓度为10umol/L），作用24h后更换新培养液，10）以后每周换液2次，每次换半液。附：解剖液（待定）接种液：DEME+血清生长培养液（待定）倒置显微镜观察：海马神经元的形态 新生大鼠海马细胞种植12h，大部分细胞贴壁，呈圆形，周围有光晕，少数细胞伸出一 二个突起。培养24h后，大部分细胞伸出三四个突起，长度为10-30um，长者可达50um，其中有些细胞发生再聚合现象。培养3d后，神经元突起进一步增多并延长，并形成稀疏的网络；而神经胶质细胞开始迅速分裂增殖，在神经元下形成一片支持层。培养12d，神经胶质
4、细胞的数量明显减少，神经细胞生长良好，胞体较大，其突起形成稠密的神经网络。培养24天后，实验组神经元细胞体不再增大，突起不再增多；而神经胶质细胞开始增多其后神经元细胞体开始萎缩、退化，突起淡化、解离，神经胶质细胞增多。神经元纯度测定：取培养的海马区神经元，用神经元特异性烯醇化酶（NSE）抗血清，进行ABC组化染色，并随机计数500个细胞，计算阳性细胞的百分率。不同时间的存活率：1. 倒置相差显微镜观察：分别取培养的海马区神经元，以上述抗血清进行免疫组化染色后，在倒置相差显微镜（200）下，随机观察并计数100个视野（0.16mm3/视野）内存活的神经细胞数2. 比色分析：对海马区神经细胞进行MTT比色分析。