虾蟹壳中的几丁质.doc

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1、一般而言，虾蟹壳主要是由几丁质（chitin）、蛋白质与矿物质三种成分结合而成，重量大约各占三分之一，但是随着虾蟹的产地不同或是品种不同，其比例会有所改变，其中矿物质的主要成分是钙盐（碳酸钙）。 目前大量生产几丁质（又称甲壳质）的方式，主要是以虾蟹的外壳或乌贼的软骨为原料，首先经洗净、干燥及粉碎，室温下用1当量浓度盐酸处理、离心、水洗后，再用摄氏 100 度的一当量浓度氢氧化钠水溶液处理，最后再以乙醇加热环流处理。其中使用盐酸是为了去除钙盐（或其它矿物质），使用氢氧化钠是为了去除蛋白质，而使用乙醇是为了去除脂质与色素。所得到的几丁质为白色粉末状，重量约占干虾蟹壳总重的 30。 何谓几丁质、几丁

2、聚糖一、几丁质、几丁聚糖之命名几丁质及几丁聚糖之英文名分别为 chitin ，chitosan，是源自希腊字语意为铠甲的chiton(发音为)，因而正式之英语发音分别为“一(chitin)” 及“(chitosan)”；日本人则依来外语发音方式分别称之为“一一(kichin)”，“一(kitosan)”；中国则依来自甲壳类动物而将之统称为“甲壳素”或“甲壳质”。至于我国何以会将chitin称为“几丁质”，而将chitosan称为“几丁聚醣”实难考究，本人推测可能是不知哪位学术界前辈依照传统(标准)的英语发音方式，将chitin发音为“一一”，因而直接将之译为“几丁”，至于“质”则可能是采用蛋白

3、质或脂质等化合物皆有质字结尾，因而于“几丁”后面加上“质” 而成了所谓的“几丁质”。另外有关“几丁聚醣” 的译命方面，何以会于“几丁”后面加上“聚醣”，推测可能是与此类物质属于多糖类有关。二、几丁质、几丁聚糖之分布几丁质在自然界中分布极为广泛，于植物细胞壁的组成分、动物中的上角皮层组织(epithelium cuticle)、海洋无脊椎动物、昆虫的外壳以及真菌菌体的细胞壁中，都可发现几丁质的存在。表三 所示的乃是一些甲壳类(crustacea)、昆虫(insects)、软体动物(molluscan)的器官以及真菌(fungi)中的几丁质含量，其中以甲壳类虾蟹壳的几丁质含量最高。 表三含几丁质之

4、部分代表 生物种类几丁质含量（%）生物种类几丁质含量（%）甲壳类鳌蟹金蟹蓝蟹红蟹小虾沙虾龙虾 72.1（器官外壳重）35（干体重）14（湿体重）1.31.8（干体重）5.8（干体重）28（外壳总干重）69.8（器官外壳重）软体动物类蛤壳牡蛎壳 乌贼南极虾 6.1（外壳总干重）3.6（外壳总干重）41(软骨总干重）4052（外壳总干重）昆虫类蟑螂甲虫山渣虫双翅虫蝴蝶蜡虫 10（干体重）515（干体重）31.3（器官外壳重）54.8（器官外壳重）64（器官外壳重）33.7（器官外壳重）真菌类黑麦霉点青素奇异青霉啤酒酵母蓝42（细胞壁干重）8.5（细胞壁干重）20.1(细胞壁干重）2.9 （细胞壁干

5、重）19（细胞壁干重） 自从1980年代末期几丁质及几丁聚糖被认为是“最后之生质”(the last biomass)以来，此类多醣类资源亦就一直被研究着，其中包括应用研究、免疫反应机制等之基础研究、相关之酵素学研究等。三、几丁质及几丁聚醣之构造几丁质、几丁聚醣、纤维素之构造如图一所示，三者间之构造极为类似。推测全球几丁质之年间生合成量约1109公吨，是为仅次于纤维素(11,011公吨)之最丰富天然有机物，至于几丁质的年产量则仅次于纤维素。纤维素分子全是经由葡萄糖(glucose)以-1,4的方式键结而成，至于几丁质及几丁聚糖虽亦是为-1,4键接结，然而所含的单体却是葡萄糖胺(glucosam

6、ine)及N-乙醯葡萄醣胺(N-acetylglucosamine)。有关几丁质及几丁聚醣两者之间的区分，实际上尚无一定之标准。有报告指出，几丁质之N-乙醯葡萄醣与葡萄糖胺的比例约为5：1(亦即去乙酸度约为16.7)；而几丁聚醣则是几丁质之去乙醯化物的总称。几丁质经由X射线之研究，依其双股螺旋以及对称轴分子的排列方向，可分为、以及三种类型：型的几丁质为斜方晶纟(rhombic)，其二股双螺旋呈反向平行(antiparallel)排列，其构形最细密，质地较为坚硬，在自然界中，此类型的几丁质属最普遍的构形，大部分的昆虫或甲壳类(虾、蟹)的几丁质即属此类。型几丁质为一单斜晶系(monoclinic)

7、，其两股双螺旋呈平行(parallel)排列，此类几丁质的组织较为松散，易被几丁质酶(Chitinase)所分解。加为贼中的软骨(squid pen)即属此类，此型几丁质经6N盐酸处理可转变为型。最后型则为型和型的混合体，如藻类和真菌所含的几丁质即属此类。几丁质、几丁聚醣之生产水产废弃物之化学组成，依原料种类及取得部位之不同而会有所差异。例如就原料种类而言，虾壳所含几丁质之比例就较蟹壳的高(蟹壳含钙量较高)，若依部位而言，脚壳部位所含几丁质量最高，腹侧所含蛋白质量最高，壳及螯钳所含钙量最高。现今被用来作为几丁质及几丁聚醣生产原料的主要是以蟹壳为主，含有2535%之几丁质、2030%之蛋白质、以

8、及4050%以碳酸钙为主之无机盐类。虾蟹壳所含几丁质由于是与蛋白质、碳酸钙、磷酸钙、少许碳酸镁、及还原型之虾红素紧密地结合者之故，于用制造几丁质或几丁质聚醣之际，必须进行运动去矿物质(demineralization)及脉动去蛋白质(deproteinization)之处理，则可得到适于生物转换(bioconversion)及其衍生物因用途广泛且具有种种生物活性(biological activity)以及农化用途(agrochemical application)所以其显得更有经济价值。图二所示的是为由蟹壳制造几丁质、几丁聚醣之流程图1。海洋生物每年合成之几丁质量高达十亿公吨之多。估计全球每

9、年所生产之几丁质产品量的十五万公吨之多，其中以市极虾(5.6万公吨)、虾蟹甲壳类(3.9万公吨)、及真菌类(3.2万公吨)为其主要来源(表四)。 表四全球潜在几丁质资源所能回收之几丁质估计量（x1,000公吨/年） 几丁质源收获量含几丁质废弃物几丁质潜在量湿重量干重量虾蟹1,70046815439南极虾18,2003,64080156蚌殻/牡蛎1,39052148222乌贼66099211真菌79079018232昆虫微量-总计22,7405,1181,640150、几丁质之制备几丁质于诸如虾蟹等甲壳类动物的壳里，是与蛋白质及矿物质(例如碳酸钙、磷酸钙)以紧密结合之方式存在着，因而于几丁质之制

10、备方面，必须进行蛋白质及矿物质之去除。从甲壳类的壳制取几丁质，可用化学法及生物法。目前工业上虽然都是采用化学法(利用酸碱处理虾蟹壳)来进行几丁质之生产，然而却有酸硷容易造成产品分子链降解(depolymerization)之类的变性问题，以及容易造成诸如酸硷中和(neutralization)及去毒(detoxification)之类的废水处理负担，而且所得含蛋白质之废液将因氢氧化钠之存在而减低其利用价值。一般而言，所用酸硷浓度过高且处理时间过长，则易造成几丁质之裂解，因而诸如醋酸或亚硫酸之类的弱酸亦被用来进行去矿物质之处理，以期能够减低几丁质之裂解，然而矿物质之去除率却相对减低。至于虾蟹壳之

11、去蛋白质方面，酵素或微生物亦有被尝试用来改进硷处理之缺点，此类方法之优点除了较化学法(硷处理法)温和之外，水解液中若含蛋白质之降解产物(例如胺基酸)，则废液尚可回收利用(例如可作为其它生产有用物质的微生物之培养液)，亦可减轻废水处理成本。田而利用蛋白质酶的这种“酵素法”，以及利用蛋白质酶生产菌的这种“微生物法”，亦就备受瞩目起来(表五)。 表五 生物性几丁质制备法 所用酵素/微生物几丁质原料微生物法Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosaPseudomonas

12、 aeruginosaBacillus subtilisBacillus subtilisLactobacillus plantarumPseudomonas maltophiliaPseudomonas maltophilia虾蟹壳粉虾头、虾壳虾蟹殻粉虾头、虾壳虾头、虾壳虾蟹殻粉虾头、虾壳虾头脱灰处理过之虾壳 脱灰处理过之蟹壳 酵素法木瓜酶凤梨酶木瓜酶木瓜酶胰凝乳酶胰蛋白酶木瓜酶市售蛋白质酶市售蛋白质酶 鲔鱼内脏蛋白质酶乳酸菌蛋白酶 虾蟹殻粉虾蟹殻粉脱灰处理过之虾殻脱灰处理过之虾殻脱灰处理过之虾殻脱灰处理过之虾殻脱灰处理过之蟹殻脱灰处理过之蟹殻脱灰处理过之蟹殻脱灰处理过之蟹殻脱灰处理过之虾头

13、综合言之。酵素法及微生物法之优点，包括(1)不会造成几丁质分子链之降解、(2)室温之下即能进行、(3)不会有硷废液处理之问题等。至于缺点则有(1)酵素作用较慢(时间长)、(2)蛋白质去除率较低。于化学法制备几丁质方面，除了去矿物质及去蛋白质之外，亦有更进而进行脂质及色素之去除者。此法乃是利用有机溶剂(例如乙醇、乙醚)去除脂质；利用强氧化剂(例如高锰酸钾)去除色素，然后再以草酸之类的还原剂除去残留之氧化剂。二、几丁聚醣之制备几丁质经由去乙醯化处理即能制得几丁聚醣。去乙醯法(1)热硷法(heatalkali)、酵素法(利用几丁质去乙醯酶(chitin deacetylase)、(3)微生物法(例如

14、利用 Aeromonas sp.之类的几丁质去乙醯酶产菌)。其中热硷法因所得几丁聚醣去乙醯度(degree ofdeacetylation；DD)较高而较常被采用。几丁质由于相邻链间有许多氢键结合而结构紧密之故，需以高浓度之硷液进行处理始能得到较高之去乙醯率(通常是在40%60%)，至于所使用之硷液量，则为几丁质干重之510倍以上(去乙醯效果才会均匀)。然而此法之缺点是为所得之缺点是为所得几丁聚醣之乙醯度及聚合度(degree of polymerization; DP)容易受到硷液之浓度、用量比例、作用时间及温度等因素所影响。至于酵素法及微生物法，虽然不会有几丁聚醣分子链降解及废硷液处理之问

15、题，然而却有时间长且去乙醯度不高之缺点。于以几丁质制备几丁聚醣之际，所使用的若系未去除矿物质之几丁质，则所得几丁聚醣产品与去除矿物质几丁质所得 之几丁聚醣产品，在分子量方面虽然差异不大，然因所存在之矿物质会与用来溶解几丁聚醣之有机酸(例如醋酸)反应成不溶物(例如醋酸钙)之故，将会导致几丁聚醣溶液酸硷值的升高及黏度之下降。此外，几丁质困难溶解而无法以溶液的方式来使用，为了弥补此缺点，研究人员积极的开发出能溶于水或有机溶剂之几丁质及几丁聚醣衍生物，此类衍生物包括乙二醇几丁质、羧甲基几丁质、硫酸化几丁质以及磷酸化几丁质等。此外，近年来几丁质寡醣(chitinoligosaccharides)及几丁聚

16、寡醣(chitosan oligosaccharides)之机能效果(例如抗菌、增强免疫以及治疗关节痛等效果)亦陆续被发现，因而有关利用酵素或微生物，由几丁质及几丁聚醣生产此类寡醣之相关研究亦就随之盛行起来。几丁质、几丁聚醣于农业之应用几丁质、几丁聚醣及其寡醣因能诱导微生物生产几丁酶，而广被用于植物病害之防治，例如直接喷洒几丁质酶生产菌(作为生物制剂)于植株表面或根圈附近即属之。此外，亦有应用生物技术(例如基因选殖)，将选殖自微生物之几丁质酶导入栽培作物染色体，而育种出具有分泌几丁质酶能力之作物。由于感染农作物之病原菌的细胞壁通常皆含有几丁质之故，若作物本身具几丁质酶活性，则能借此而达到抑制植

17、物病原真菌侵袭之效果。亦即，当病原菌入侵时，植物会经由识别而分泌出大量之几丁质酶，用来分解植物病原真菌细胞壁上之几丁质。经由此种酵素水解所产生之几丁质寡醣，能够经由植物细胞膜上之感受器的认知，而活化位于植物细胞膜上的蛋白质激酶。此酵素借由催化细胞内酵素的磷酸化(酵素活化)，而启动植物防御系统产生诸如干摄素(interferon)、酚类化合物之类具有抑菌效果之物质，此过程亦能促使植物之木质化(lignification)而达到隔绝病原菌侵害之效果。至于促进作物生长方面，则有如下之相关论文发表，(l)Hirano andHayashi (1987)：添加0.1%低分子几丁聚醣或几丁聚寡醣有益廿蓝菜

18、生长(1.2及1.5倍)，CM几丁聚醣(高分子)则是反效果；(2)Hayashi et al.(1987)：以低分子几丁聚寡醣包覆萝卜种子能增加近两成收获量，高分子几丁聚醣则是无效；(3)Fukui et al.(1989)：几丁聚醣包覆种子、几丁聚醣混合土壤，借由活化植物细胞而增加肥料成分(氨、钾)之吸收率。虾蟹壳废弃物之微生物再利用化学农药在作物栽培体系里，一直是为病虫害防治之主要方法。大量施用化学药剂已导致抗药性病虫之发生、以及因生态环境之遭受残留药剂污染，而衍生出不少影响人类生活之环保问题。因此，开发无污染或危害性低之生物农药，已成为目前全球所瞩目的生物科技产业重点之。生物农药乃是利用

19、自然环境中之生物体及其所产生之天然代谢产物作为防 治病虫害或杂草之药剂，其对非目标生物之毒性普遍较低，寄主专一性较高，对环境生态影响小、冲击低，而且目标病虫害草较不易产生抗药性。因此，欧、美、日等各国均已纷纷投入新产品之开发，包括生物杀虫剂、生物杀菌剂及生物除草剂等。因少有报告直接利用虾蟹壳废弃物作为微生物生产酵素之主要碳源，著者因而尝试直接以市售之廉价虾蟹壳粉(shrimp and crab shell powder； SCSP)为主要碳源，由新竹南寮渔港土壤筛选到一株合乎此目的且耐硷性之几丁质酶生产菌P-187。不仅虾蟹壳粉，就连酸硷处理过之虾蟹壳粉或酸硷废液亦能被用来作为生产几丁质酶之主

20、要碳源，以酸/硷处理过之虾蟹壳粉比未处理之虾蟹壳粉更适于用来作为K187菌生产几丁质酶之主要碳源。利用蒸煮粉碎处理过之虾蟹壳粉作为筛选耐硷性几丁质酶生产菌之基质。由新竹南寮渔港土壤节选所得菌株Pseudomonas aeruginosa K-187具有较佳之几丁质酶生产性。利用虾蟹粉经由酸及或硷前处理所得各种不同制品作为K187菌生产几丁质酶之碳源，结果发现虾蟹壳粉若经适当前处理，则更适于用来作为生产几丁质酶之碳源。当以酸/硷处理过之蟹壳粉代替未处理过之虾蟹壳粉作为碳源结果以现，此菌之几丁质酶最大生产量能由0.68U/ml提升为2.4U/ml。此结果显示K-187菌株于以酵虾蟹壳粉及其酸硷处理

21、废液生产几丁质酶之同时，亦能用来回收再利用几丁质生产业制程所衍生之此类酸硷废液。K187菌所生产两种几丁质酶经进一步分离纯化结果，证明是为最先被发现源自微生物之双机能几丁质酶/溶菌酶。K187菌发酵虾蟹壳所得之发酵液里。除了含有具抗细菌效果之几丁质酶之外，尚含对植物病原霉菌具抗菌效果之其他成分。此一抗霉菌成分经分离纯化结果，证明是为分子量66 kDa之高分子复合醣类，并且将之命名为pafungin。经由显微镜观察发现，pafungin藉由造成霉菌菌丝膨胀，而对植物病原性霉菌Fusaritum oxysporum及其他多株病原性霉菌具有抑制生长之效果，此种抑制植物病原霉菌感染之效果亦经苜蓿芽实验

22、获得证实。此外，亦于种植山药之有机农场进行田间试验结果，证实能够有效防止青枯病之发生。K187菌所生产几丁质酶可共价键结于简称AS-L的这种能随pH值变化而改变可溶性的高分子聚合物上。另外亦发现，此菌所生产之pafungin亦能被固定化于此种担体，且维持所具之抗菌活性。K187菌发酵虾蟹壳废弃物所得之发酵液里，除了含有上述两种具抗细菌活性的几丁质酶，以及对于植物病原霉菌具有抗菌效果的pafungin之外，尚具能够用来进行虾蟹壳去蛋白质之用的蛋白质酶活性。于生产生物农药/肥料之微生物再利用 未利用生物资源的开发是无限的宝库我国水产资源之主要用途当然系属食用，其中废弃物比例分别高占鱼体全重的50%

23、、贝及虾蟹类的6080%，除了部分有被用来加工成鱼粉或虾蟹壳粉等廉价肥饲料之外，其余大都任遭废弃。此类未被有效回收再利用之所谓“废弃物”，若能配合现代生物科技进行研发，则将因能开发出高附加价值产品，而重新被认定为具有开发潜力之宝贵的“未利用生物资源”(unutilized bioresources)。 于水产废弃物之资源再利用方面，现今之研发特别重视于如何将水产加工业所衍生出之残渣(未利用部分)，生产出高附加值之物质。例如从鲔鱼或鲣鱼眼睛回收DHA及EPA(两者皆属有益人体健康之多元不饱和脂肪酸)；自鲑鱼头部萃取脑下垂体；自洄游鱼类血合肉萃取辅酶、有机铁、维生素及增血剂；利用鱼鳞所含之磷灰石(

24、apatite)作为牙膏研磨剂；利用乌贼墨汁作为食用黑色素及抗癌物；以及北欧所开发出由鱼类废弃物萃取酵素，并且成功地应用于鱼的脱皮加工等。如表一所示，已有业界自水产物制取酵素制剂及荷雨蒙剂，特别是为鱼油所含大量不硷化物里，含有高浓度之胆固醇。胆固醇因是造成动脉硬化或高血压之原因物而受厌恶，然而于以含胆固醇之鱼油制造肥皂之际，若将所分离出之不硷化物进一步分离则可得到胆固醇，是为最近电子设备所常用之液晶及化妆品材料。此外，可供作为健康食品材料之二十碳五烯酸(EPA)及二十二碳六烯酸(DHA)等，亦可由萃取鱼油而得。几丁质及几丁聚脂之相关研究，近年来已不仅止于基础分析而已，其实用价值及工业化潜力方面

25、之研究，亦正被积极的进行着。几丁质及几丁聚醣之应用范围非常广，其主要用途包括污水成理、食品、医疗材料以及农业用途等。虾蟹壳以往一直被视为废弃物，然而最近则因所含几丁质之种种用途的被发现而特别受到瞩目(表一)。表一 水产废弃物所含高附加价值物之回 高价物名废弃物之原料名主要用途几丁质、几丁聚醣虾蟹壳或乌贼软骨凝集剂、化妆品素材、医药用材料虾红素虾蟹壳食品添加物、饲料添加物酵素虾蟹壳医药品胆固醇鱼油液晶、化妆品素材多元不饱和脂肪酸(EPA,DHA)鱼油健康食品牛胆素贝类、乌贼、章鱼之蒸煮废液健康食品、医药品复合多醣乌贼墨汁医药品食用黑色素乌贼墨汁食品添加物脑下垂体鱼头医药品辅酶Q鱼之血合肉医药品有

26、机铁鱼之血合肉健康食品、医药品核糖核酸(RNA)沙丁鱼或鲑鱼之幼鱼健康食品、食品保存料精蛋白鲑鱼或鲱鱼之精巢健康食品、医药品角鲨烯鲨鱼类之肝脏化妆品素材磷灰石鱼骨生物性、陶材(人工骨、人工齿根)呈味成分水产物蒸煮废液天然调味料纤维多醣藻类加工残渣健康食品作者主要是利用虾蟹壳废弃物作为微生物之主要碳源，由土壤中筛选出具抑间植物病原菌效果之菌株，然后借此生产具抑制植物病原菌之有效成分，并经田间试验来确认其作为生物农药之可行性。研究之目的乃是期能借由微生物发酵此类虾蟹壳废弃物，生产出具抑制植物病原菌效果作用之成分，并且进行田间试验来探讨实际运用于防治植物病原菌之可行性，以改善目前困化学农药的滥用以及

27、废弃物污染所对环境造成之伤害。本文拟就虾蟹壳废弃物经酸碱处理生产几丁质相关物质，以及著者执行国科会整合型计划(微生物发酵虾蟹壳生产生物农药/肥料)之相关结果予以介绍。 表二几丁质及几丁聚醣之特性及应用 特性/应用几丁质几丁聚醣衍生物形成电解质复合体 天然高分子凝集剂 形成藉合物 放射性元素之回收重金属离子之去除、杀菌剂回收海水中之铀离子交换 阴离子交换层析担体阳离子交换层析担体吸附去除毒素、脱色、增强染色性去除毒素、脱色、增强染色性 制酸 食品加工之酸中和 分子识别（亲和）亲和性层析担体亲和性层析担体亲和性层析担体保水、乳化乳化制（食品安定制）保湿制（化妆品）、土壤改良剂保温剂控制释放性医药品、农药、营养素、香味释放医药品、农药、营养素、香味释放 胶体化 胶体层析担体、 酵素固定化担体、化学生化反应触媒、隐形眼镜 形成膜 分离膜分离膜、覆层（头发化妆品，种子）分离膜 搞微生物 抗菌剂（食品保存）、抗蛀齿剂抗霉剂 抗胆固醇 胆固醇下降剂、机能性食品，医用材料、饲料 双叉桿菌食品添加 食品添加 细胞活化 免疫增强剂、抗癌剂，感染症预防免疫增强剂、抗癌剂，感染症预防、诱发植物防御系统免疫增强剂、抗癌剂 伤口愈合 吸收性缝合 线、人工皮肤 凝血 止血剂、医用材料止血剂，医用材料 肝素代用物 热分解性食品风味制造 音响音箱之振动校 乐器用材之全音域共鸣化 光折射 液晶