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1、HPLC反相色谱法流动相常用的乙腈和甲醇比较1，首先，乙腈价格高乙腈，特别是HPLC级的价格很高，但是，文献或LC厂家所示的条件，多用乙腈，这是为什么呢？现就此谈谈。2，吸光度，乙腈HPLC级的小。乙腈和甲醇的市销HPLC级和优级的吸收光谱中，乙腈HPLC吸收最小（特别是在短波长上小）。所谓HPLC级是除去具有吸收UV的杂质，在规定的波长上吸光度限制在规格值以内。在UV检测时，产生的噪声小，因此在进行UV短波长上的高灵敏度分析时乙腈HPLC级最适宜。另外，在UV检测中的梯度基线上也是乙腈HPLC级产生鬼峰少，虽然，其他与水相溶性高的有机溶剂有各种各样，但很难能找到比乙腈HPLC级吸收更小的。另
2、外，甲醇的HPLC级和优级，虽然所得的光谱相差不大，但是优级不能保证吸光度，有可能产生偏差，价格也相差不大，所以尽量使用HPLC级。3，压力,乙腈低.柱内承受的压力,根据有机溶剂的种类或混合比率的不同而异,水/乙腈,水/甲醇混合液的比率与输液压力的关系中,甲醇与水混合,压力增高,而乙腈同样与水混合且并不如此.所以,乙腈一方,在同样的流速下不在柱内加上多余的压力.从上述两项,可以确认使用乙腈的意义,那么,甲醇除了价格以外,还有没有其化优点呢?4,洗脱能力,一般而言,乙腈较强.乙腈和甲醇分别用同样的比率与水混合时,一般情况下,乙腈的洗脱能力强.特别是混合比率低时,从咖啡因和苯酚的洗脱来看,获得同样
3、的保留时间,乙腈的比率,只需甲醇的比率的一半以下即可.另一方面,有机溶剂100%或与此极接近时,从胡萝卜素和胆甾醇来看,常常都是甲醇的洗脱能力强.混合比在50比1等较为特殊时,调制的误差大,影响保留时间,或平衡化的时间长,乙腈遇到这种情况时,用甲醇的10比1混合代替乙腈,这样操作方便些.溶剂受温度影响时,不采用容器定量,而采用重量的方法(考虑比重),可使混合比的误差减小. 5,分离(洗脱)的选择性.两者的差异,乙腈和甲醇在分离的选择性上不同.由于有机溶剂分子的化学性质(甲醇和乙醇是质子性,乙腈和四氢呋喃是非质子性)不同所致.因此,在用乙腈类不能获得分离的选择性,就试用甲醇类看看.6,峰形,用时
4、出现差异.像水杨酸化合物(在邻位上具有羧基或甲氧基的苯酚化合物)等,用乙腈类时拖尾大,用甲醇类可抑制.可是,一般情况下,聚合物类反相柱,与硅胶柱相比,更具有峰形宽的倾向,特别是用聚苯乙烯分析柱芳香族化合物等时常见.这在流动相是甲醇时非常显著,而用乙腈时不明显.为此,用聚合物类反相用柱时建议采用后者(乙腈类),这是因为乙腈使凝胶膨润. 7,流动相的脱气,乙腈类要注意.混合溶剂的置制,不说在LC装置内,只谈预先在流动相瓶内进行时,(等浓度系统).甲醇与水混合时发热,多余的溶解空气较易变为脱出气泡(脱气容易).而乙腈由于吸热冷却,随着慢慢回到室温,产生气泡,所以要考虑脱气(加温搅拌,过滤膜,He脱气
5、等). 8,结论以上反相色谱法流动相常用的乙腈和甲醇进行了比较.粗略地讲是,使用乙腈HPLC级最好,在选择性,峰形差时试用甲醇HPLC,但根据各种不用性质设计分析条件也是必要的.选择流动相是我们要考虑的因素:1能够适当的溶解样品,并且与非样品不发生反应2与其他使用的流动相能混合3粘度低,不为柱子增添其他负担4用UV检测器时,样品的检测波长里没有UV吸收5用RI检测器时样品的曲折率与流动相的曲折率差别明显6沸点与分析温度之间要有一定差距,避免产生气泡7不容易引燃,爆炸8对人体无害9廉价UV检测器或荧光检测器使用的时候需要注意的是，由于溶剂的不同可测定的波长范围也有所不同，使用的溶剂自身也有吸收特
6、性，导致基线漂移，或者样品不出峰的情况。在下图中列出了HPLC常用的一些有机溶剂的紫外吸收特性，如果说UV检测中最普遍被用到的波长为254nm的话，苯（倒数第三行）与甲苯（倒数第二行）的透过率就很显然不符合要求。而乙腈（第一行）和甲醇（第三行）都能符合要求液相色谱柱的保存1.反相色谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。2.长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存
7、于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。色谱柱的保存方法A几天之内的短期放置，应先用溶剂冲洗好色谱柱(如凝胶柱则用蒸馏水来冲洗) ，再把色谱柱的两头用密封螺丝密封好即可。B如果色谱柱长期不用，应使用色谱柱使用说明书中所指明的溶剂来充满色谱柱，再把色谱柱的两头用密封螺丝密封好即可。C色谱柱应贮存在4-室温下，如果放置于0以下的环境里，柱内就会结冰，这也将导致柱效的降低。D注意溶剂的PH值，一般硅胶基质的色谱柱控制在28范围内。贴心提示：首先柱子必须清洗干净后才能贮存，柱子不能贮存在水或水性溶剂中，否则
8、会引起微生物的滋生。如果您使用的流动相中含有盐，请首先用高比例水冲洗（3%-5%有机相，1ml/min流速，冲洗30至40分钟），然后再用纯乙腈冲洗30分钟一定要将色谱柱的两端封严, 以防止由于溶剂挥发而造成的柱填料干缩现象，引起柱子结构的几何学改变，这可导致柱效的严重降低。不同的色谱柱，采用不同的流动相保存的，反相色谱柱，就直接用甲醇。正相色谱柱就用正已烷了，如手性手色谱柱，不同的型号，要根据柱子的要求进行存放的。如果长时间不用的话，最好是找个容器，用甲醇或乙腈把色谱柱浸泡起来。1，反相色谱柱一般都用纯乙腈饱和放置2，正相色谱柱用正己烷饱和放置；3，手性色谱柱一般用90HEX:10IPA,也有用90HEX:10EtOH的，针对柱子；4，反相手性色谱柱用40ACN:60H2O饱和放置；总之柱子要保存在溶剂中，不然柱子干了，基本就没什么用了！