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1、mRNA差别显示技术mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）简称为ddRT-PCR。标本检测，你提供标本，我免费给你做实验，成果归你享有Q往圣科技3452125268它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。差别基因表达（differential gene express）是细胞分化的基础。基金论文，你提供实验材料，我免费给你做实验，成果归你享有Q往圣科技3452125268 1、 mRNA差别显示技术
2、正是对组织特异性表达的基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。该方法的基本原理是首先选取不同的组织样品或不同发育阶段的同一组织样品或同一组织样品经不同药物处理诱导的样品，经总RNA提取后，Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送进行mRNA反转录合成cDNA。此cDNA的合成是采用Oligo（dT）12 MN为引物，其中M为A，C，G中的任意一种，N为A，C，G或T中的任意一种，所以共有12种oligo（dT）12 MN引物，其中M称为锚定碱基，起增大引物Tm值的作用，N称为分类碱基，对反转录进行分类。Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRIS
3、PR/cas9免费送用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，从而使反转录的cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类（目前较为流行的方法是进行4种归类，即M为简并碱基的形式存在），在此基础上对每一类cDNA进行随机引物和反转录引物PCR扩增，通过对组织样品的同一类cDNA的PCR选择性扩增产物凝胶电泳分析，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上组织特异性的表达。如此众多种类的mRNA反转录产物经PCR选择扩增后其类型依然为数众多，很难用电泳系统加以快速准确地分离Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费基
4、因慢病毒包装。因而需要对反转录产物cDNA进行归类处理，减轻不同PCR产物电泳分离的难度，提高分离的准确率。（见示意图）实验流程：Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装对照组的总RNA提取mRNA完整性鉴定实验组的总RNA提取mRNA完整性鉴定 锚定引物逆转录成cDNA锚定引物逆转录成cDNA 采用随机引物和逆转录引物进行选择性PCR扩增采用随机引物和逆转录引物进行选择性PCR扩增 扩增产物进行凝胶电泳分析差异性条带的回收与第二次扩增Northern杂交，Southern杂交再次确定差异性条带的真实性差异性条带的克隆、测序、分析，DNA及氨
5、基酸序列联机检索以差异性条带为探针克隆出基因组文库中的基因序列及cDNA文库中的全长cDNA序列基因功能的鉴定：knock outdominant negative mutation原核系统或真核系统中的表达翻译。抗体的制备，细胞内的定位，抗体抑活等等。one hybrid判断出该基因的“启动”基因。two hybrid判断出该基因的产物的作用途径。这里以CLONTECH生产的DeltaTM Differential Display Kit为例，介绍具体的实验步骤。该试剂盒中含有10种任意引物和9种Oligo(dT)引物。操作步骤1总RNA的提取（见Northern 杂交）2第一链合成：(1)
6、总RNA样品 2g；cDNA合成引物 1l；加ddH2O补至5l。将管标号为1A,2A,PC A等。PC为阳性对照。(2)混匀后稍离心。(3）70孵育3min，冰浴2min后稍离心。(4）准备dNTP mix (以5管为例 ) 每管 5管 5第一链缓冲液 2l 10l dNTPmix（各5mM） 2l 10l MMLV逆转录酶（200u/l） 1l 5l 总体积 5l 25l(5）每管加入5l，混匀后稍离心。(6）42孵育1hr。(7）75 10min终止反应后置冰上，稍离心。(8)将2l反应液分别转至新管中（新管标号为1B,2B,PC B等）。(9) 将78l ddH2O分别加入B管中,混匀
7、。(10)将72l ddH2O分别加入A管中，混匀。(11）将所有cDNA稀释液 -20保存待用。3dd-PCR: 以 引物P1,T9为例说明 （0.5ml PCR管,1代表对照组,2代表实验组） 管号 cDNA样品 引物 (1) 1A P1,T9 (2) 1B P1,T9 (3) 2A P1,T9 (4) 2B P1,T9 (5) H2O P1,T9 (6) RNA1 P1,T9 (7) RNA2 P1,T9 以下为阳性对照反应体系 (8) PC 1A P10,T8 (9) PC 1B P10,T8 (10) PC 2A P10,T8 (11) PC 2B P10,T8 (12) H2O P
8、10,T8 (13) PC RNA1 P10,T8 (14) PC RNA2 P10,T8 在PCR 管中加入: cDNA样品 1l P引物 1l T 引物 1l 准备其它 PCR试剂的混合液: (在另一管中加入) 成分 每管(l) 所需管数( n=14) 10buffer 2.0 2n ddH2O 14.0 14n dNTPmix 0.2 0.2n -32P dATP 0.4 0.4n Taq酶 0.4 0.4n 终体积 17.0 17 n 混匀后稍离心。 将17lPCR混合液加入各反应管，则各管总体积为20l。 开始PCR扩增。 PCR循环参数： 在GeneAmp PCR Systems
9、2400 & 9600 扩增仪上执行以下程序： 94 5min 1 cycles 40 5min 68 5min 94 30sec 2 cycles 40 30sec 68 5min 94 20sec 23 cycles 40 30sec 68 2min 1 cycles 68 7 min。 反应结束后置-20保存备用。 4电泳和放射自显影(1）配制6%变性聚丙烯酰胺凝胶，灌注测序板。(2）预电泳30min。(3）每个dd-PCR反应取出5l于一新微量离心管中，加5l loading buffer，混匀，离心，置94变性2min。立即置冰浴。(4)停止预电泳，冲洗加样孔。(5)加样2l。70W
10、电泳2.75hr至二甲苯青到达胶的底部。(6）下胶：（同测序胶）(7）干胶：在胶表面覆上保鲜膜，80干胶30min。(8)X光片-70曝光过夜或更长时间(根据射线强度而定)。图2-6显示了dd-PCR放射自显影的X光片5差异条带回收再扩增(1）X光片经D72显影、酸性定影液定影后，水洗晾干。置X光片灯上比较寻找差异条带。用一次性手术刀片在胶上切割差异条带，加ddH2O 20l，沸水浴15min，离心取上清为模板。(3) 以原引物扩增： 回收DNA 7 l 10PCR buffer 5 l 5mM dNTPmix 0.5 l 引物P 2.5 l 引物T 2.5 l Taq酶 2 l 加ddH2O至总体积为50l执行PCR程序: 933min；931min601min682min，20次循环；685min。2、 取PCR产物10l 2%琼脂糖电泳检测。你提供质粒，我给你免费包装成慢病毒Q往圣科技3452125268你提供质粒和细胞，我给你免费构建稳定表达细胞系Q往圣科技3452125268PCR产物乙醇沉淀，10lddH2O溶解。6以PCR产物为探针，标记后进行Northern杂交，证实基因的真实性。7PCR产物的TA克隆。8DNA序列测定。9检索分析。