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1、实验五黑曲霉发酵生产柠檬酸柠檬酸（citric acid）又名枸橼酸，学名 2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid）2-羟基丙烷-I ， 2， 3-三羧酸（2 一 hydroxy propane-1 ， 2，3 triearboxylic acid） 。商品柠檬酸 有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C6H8O7 H2O,相对分子质量为210.14。另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为GHO,相对分子质量192.13。柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、
2、清洗（洗涤）、建筑等工业部门。其中食品和饮料业占 56%，清洗（洗涤剂）业占20 %，医药和化妆品占11%，其他工业占13%。1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。.1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。最具商业竞争优势的是采用黑曲霉、文氏曲霉和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。目前国内外普遍采用黑曲霉
3、的糖质原料发酵生产柠檬酸。本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产生柠檬酸。柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。将获得柠檬酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性炭脱色、离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP- 98版标准的无水或一水柠檬酸。一、实验目的了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及中间分析方法。二、实验原理黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖
4、；葡萄糖经过糖酵解途径（EMP和HMP途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶 A,然后在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的a 酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬酸处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为：C6H12O + 1.5O2T C6HO+2H2O柠檬酸理论得率为106.7 %，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7 %。三、实验装置与流程（1）实验装置与材料： 实验装置：旋转式摇床、恒温培养箱、高速离
5、心机（40006500r / min）。 菌种：黑曲霉柠檬酸生产菌株CO8-27。 材料：麸皮，马铃薯，薯干粉，蔗糖，玉米粉，大麦芽，大米，琼脂，淀粉酶（中温酶与高温酶）。 器皿：15mL试管，100mL三角瓶，2000mL烧杯，500mL三角瓶，离心管若干。 试剂：0.1429mol / L NaOH, 1 %酚酞试剂，费林甲，乙溶液，0.01 %标准葡萄糖溶液。（2）实验流程：保藏菌株活化菌株（斜面培养）；200mL三角瓶麸曲培养5001000mL三角瓶 液体发酵（3）斜面培养基： 马铃薯琼脂培养基：去皮马铃薯200g切成小块，加水约500mL,煮沸30min，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖2
6、0g，琼脂20g 溶化后自来水定容至1000mL,分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内， 121C灭菌20min，取出摆成斜面备用。 麦芽汁琼脂培养基：2/3大麦芽加1/3大米磨碎成粉，按麦芽粉：水：1 : 4比例加水，置60 C 下糖化4h至碘液显示无色，然后离心 15min，获得麦芽汁（或取啤酒厂未加酒花的麦芽汁 ）调整浓度 5 Bx,添加25g/L琼脂，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内。于 121C灭菌 1520min，取出摆成 斜面备用。 一级种子（麸曲种子）培 ，养基：A .含麸皮的查氏培养基（g/L）:蔗糖 30; KNO 1.0 ; K2HPO1.0 ; MgSO 700.5; KC
7、I0.5 ;FeSO - 7H00.01;调节pH7.07.2，加水定容至1000mL,添加800g麸皮，拌匀至无干粉又无结团， 分装入810个500mL三角瓶中，塞入8层纱布并包扎好。于121C下灭菌30min，趁热摇散，冷却至 35C备用。B .麸曲培养基：取新鲜麸皮，用60目筛子筛去细粉， 按麸皮：水：1: （1.01.3）比例加水， 拌匀至无干粉又无结团，或用水洗麸皮表面，挤去水分至有水感而水不下滴为宜。上述麸皮装入500mL三角瓶中，每瓶装80100g湿料，塞入8层纱布并包扎好。于121C下灭菌 30min，趁热摇散，冷却 至35C备用。 摇瓶发酵培养基：取细度为 40目以上的薯干粉
8、68g,装入500mL三角瓶中，再加入40mL水和 5个单位a 一淀粉酶（中温）/g薯干粉，于7580C下液化15min,瓶口塞入8层纱布包扎好，于110C 灭菌1520min，冷却备用。取细度为60目以上的玉米粉300g装入2000ml烧杯中，加入1000mL水和78个单位a 一淀粉酶（高温）/g玉米粉，于80C液化lOmin后，继续加热至90C保温30min，碘检不变色后，再加热到1OOC 煮沸（5lOmin），趁热经过二层纱布过滤，滤液加水冷却并调整糖度至15%20 %和蛋白质含量不超过4g/L，取过滤清液40mL分别装入500mL三角瓶中，瓶口塞入 8层纱布包扎好，于121C灭菌15
9、20min，冷却备用。四、实验步骤及方法（1）种子制备： 斜面种子制备：用接种环挑取冰箱保存的斜面菌种一环于斜面培养基上，于35 C恒温箱中培养35d,待长满大量黑色孢子后，即为活化的斜面种子。 孢子悬浮液的制备：用无菌移液管吸取5mL无菌水至黑曲霉斜面上，用接种环轻轻刮下孢子，装入含有玻璃球的三角瓶中，盖好塞子振荡数分钟。每支斜面的孢子悬浮液可接23瓶麸曲三角瓶。 吸取孢子悬浮液2mL接入上述麸曲种子培养基中，然后摊开纱布、扎好，并在掌心轻轻拍三角瓶，使孢子与培养基充分混合，于3032C下恒温培养Id后，再次拍匀，于35C下培养，每隔1224h摇瓶一次，孢子长出后停止摇瓶，这样继续培养34d
10、 ,即成种曲。（2）摇瓶发酵培养：将麸曲孢子（或直接将斜面种子）接种于上述薯干粉或玉米粉的摇瓶发酵培养基中。接种量：一支斜面接45瓶，一瓶麸曲孢子接2035瓶。500ml三角瓶装液量为40mL,于转速为 200r / min（ 24h 前为 I00r / min, 24h 后为 200r / min）、300r / min（ 24h 前为 I00r/mi n , 24h 后为300r /min）旋转摇床上，35C下培养34d。（3）发酵过程检测： 发酵0、24、48、72、96h分别各取下两瓶检测残糖、柠檬酸含量，以观察发酵过程中黑曲霉 的耗糖与柠檬酸生成速率。 柠檬酸含量检测：一般检测发酵过
11、程中的总酸，采用0. 1429mol/ L NaOH溶液滴定发酵过滤清液。 总糖及残糖（还原糖）测定：采用费林试剂法。五、实验结果与记录表5-3黑曲霉柠檬酸摇瓶液体发酵发酵时间/h残糖/%柠檬酸（）总酸含量/%糖酸转化率/%0瓶1瓶224瓶1487296反应条件：24h 前为 lOOr /min , 24h 后为 200r / min表5-4黑曲霉柠檬酸摇瓶液体发酵发酵时间/h残糖/%柠檬酸（）总酸含量/%糖酸转化率/%0瓶1瓶224瓶1瓶248瓶1瓶272瓶1瓶296瓶1瓶2反应条件：24h前为lOOr /min , 24h后为300r / min六、实验数据处理（1）平均耗糖速率（g/h）:糖）单位时间内黑曲霉消耗糖 （还原糖）的克数。（2）平均柠檬酸生成速率（g/h ）单位时间内黑曲霉生成柠檬酸的克数。（3）糖酸转化率（）:黑曲霉生成柠檬酸的克数与消耗糖（还原糖）的克数之比的百分数。七、思考题（1）试以发酵时间为横坐标，以糖消耗量、柠檬酸生成量、糖酸转化率为纵坐标作图，说明三 者随发酵时间的变化，并加以分析。4