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1、聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离蛋白质和寡核苷酸。其应用可以分为两大类，一类是属于可以直接在凝胶上观察计算；另一类需要洗脱回收胶中特定的蛋白和核酸。 蛋白质纯度分析 蛋白质分子量测定 蛋白质纯化分离 直接观察 蛋白质定量 洗脱回收蛋白 蛋白质水解分析 免疫印迹的第一步 DNA测序 1. 蛋白质纯度分析 根据聚丙烯酰胺凝胶条带个数来判断是一种蛋白质还是多种蛋白质的混合物。2. 蛋白质分子量测定采用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。SDS-蛋白质复合物消除了蛋白质天然形状不同对电泳迁移率的影响，SDS-蛋白质复合物的迁移率只与蛋白质分子量有关，研究表明蛋白质分子的电泳迁移率与其分
2、子量对数呈线性关系，因此能够根据电泳迁移率的比对获得未知蛋白质分子量大小。以迁移率Rf为横坐标，蛋白分子量的常用对数为纵坐标。用已知分子量的蛋白测出迁移率，做标准曲线。从而能根据未知分子量蛋白的迁移率计算出其分子量。其中Rf=蛋白迁移距离/示踪染料迁移距离。3. 蛋白质定量 蛋白质混合物中单个蛋白质的定量，通常是将染色后的凝胶蛋白质条带在分光光度计上进行扫描，然后对峰面积积分。4. 蛋白质水解分析 蛋白质水解分析常用酶谱法。明胶酶谱法的基本过程是先将样品进行非还原性SDS-PAGE（含0.1%明胶）电泳分离，然后在缓冲系统中使样品中的酶恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮
3、蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与酶的量和比活成正比。5. DNA测序 目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。 Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸
4、，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。 Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记
5、进行检测。6. 蛋白质纯化分离 电泳后找切一条泳道进行染色，找到目标蛋白的位置，将未染色的凝胶进行蛋白质洗脱。洗脱方法有电扩散法和电洗脱法等。电洗脱法步骤：SDS-PAGE电泳后，用250mM KCl染色10分钟（或用考染），蛋白带呈乳白色；手术刀切下蛋白带，放入透析袋中；将透析袋放常规平板核酸电泳槽，加入与SDS-PAGE相同的电泳buffer；80V电泳2-2.5小时，再反向电泳1-2分钟；吸出透析袋中液，浓缩（可用冻干、丙酮沉淀等）；SDS-PAGE电泳检查电洗脱效果。7. 免疫印迹的第一步 免疫印迹法是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检
6、测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。免疫印迹法可非常有效的鉴定某一蛋白质的性质。将蛋白质固定在膜基质上比直接在凝胶上检测更有优势，因为蛋白质在膜上更容易让试剂接近，膜比凝胶更容易操作，试剂用量更少，更省时。 免疫印迹法分三个阶段进行.第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快.此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）.第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（12A），通电45min转移即可完成.此
7、阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见.第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色.常用的HRP底物为3,3-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）.阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量.本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断.在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验.抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒,可方便地在实验室中供检测用.根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。