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1、高效液相色谱法分析芳香类化合物一、 实验目的：1、 了解高效液相色谱仪的基本结构、原理及操作。2、 了解色谱分离的基本原理，反相分配色谱的基本规律。3、 掌握色谱的基本定性、归一化法定量方法。二、 实验原理：以液体为流动相的色谱称为液相色谱，根据在两相分离过程的物理化学原理不同可分为吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱、离子色谱、亲和色谱等。本实验主要是分配色谱。分配色谱即液液色谱，是基于样品分子在包覆于惰性载体上的固定相液体和流动相液体之间根据样品分配系数不同达到分配平衡。反相分配色谱即流动相极性比固定相大。反相分配色谱用的是非极性填料分析柱（如ODS-C18），流动相是极性较强溶液（如甲醇和水）。
2、色谱条件主要包括色谱柱、流动相组成与流速、色谱柱恒温箱温度，检测波长等。芳香族化合物含有共轭双键，对220nm,254nm的紫外光有较强的吸收，可通过分配色谱分离检测，本实验采用反相HPLC检测。三、 实验仪器及试剂：实验仪器：Agilent 1100型液相色谱仪：真空在线脱气装置、四元梯度泵、多波长检测器。 ODS-C18柱试剂：甲醇（色谱纯），水（超纯水）， 苯、萘、菲的甲醇溶液，苯、萘、菲的混合液。四、 实验步骤：1、 确定实验条件打开计算机，等启动完毕后依次打开输液泵、真空在线脱气装置、柱温箱、检测器开关。（实验前已操作）通讯完毕后，设定操作条件。流动相：甲醇/水=80/20；总流速0
3、.500ml/min，设定在220nm，254nm两个波长进行检测30。2、 定性分析流动相比例设为甲醇/水=80/20，等基线平稳后依次将苯、萘、菲的甲醇溶液进样5L，得出三种标准物质的保留时间。将三种物质的混合溶液进样5L同样实验条件下比较各峰的保留时间。3、 定量分析（面积归一化法）将上述混合液的定性谱图对应物质的3个峰面积积分校正因子校正后归一化计算（254nm）。4、 流动相组成对混合样保留时间的影响梯度条件1：时间/min函数函数0更改溶剂组分溶剂组分A：80.0% B: 20.0%4更改溶剂组分溶剂组分 A：90.0% B：10.0%5更改溶剂组分溶剂组分 A：100.0% B：
4、0.0%设定开始时流动相甲醇：水=80:20，平衡至基线稳定后开始进样，完成一次梯度洗脱后，用甲醇：水=80:20的流动相平衡约10min，开始第二次梯度洗脱。梯度条件2：时间/min函数函数0更改溶剂组分溶剂组分A：80.0% B: 20.0%3更改溶剂组分溶剂组分 A：90.0% B：10.0%4更改溶剂组分溶剂组分 A：100.0% B：0.0%5、 关机 用纯甲醇冲色谱柱约半小时，基线平稳后在工作站上关闭输液泵、柱温箱、检测器，然后关闭工作站，依次关闭仪器上检测器、柱温箱、输液泵的电源开关。关闭计算机。五、 实验数据处理及结果分析:表三：苯萘菲校正因子苯萘菲校正因子1.000.080.
5、011、 定性分析：根据实验可得在一定实验条件下（如实验步骤设定），220nm，254nm下苯、萘、菲的保留时间如下：表四：实验测定标准物质保留时间苯/min萘/min菲/min220nm4.6075.7287.528254nm4.6065.7277.528由实验所得数据可看出，同种物质在不同实验波长下的保留时间基本保持不变，即物质的保留时间与实验发射波长无关。（1） 影响保留时间的主要因素有色谱柱规格、柱温，流动相组成、流速，进样器到色谱柱间管线的规格等，同一种物质在相同实验条件下测得保留时间与发射波长无关，发射波长只影响物质出峰的强度。（2） 由于反相分配色谱中流动相极性比固定相大，故极性
6、大的溶质易被洗脱，故极性大的溶质保留时间较短，故实验中三种物质的极性苯萘菲三种物质的混合物在同样实验条件下三个峰的保留时间为：表五：混合物各峰保留时间123220nm4.6065.7327.524254nm4.6065.7337.524由实验所得数据结合标准物质定性保留时间测定数据可看出，1、2、3三种物质分别对应苯、萘、菲，不同实验波长下同种物质的保留时间相同，但混合物中物质的保留时间与纯物质中保留时间略有差异，说明其他同类型物质会对物质保留时间有影响。（混合物中其他物质的存在可视为溶剂组分不同，溶剂的极性改变导致物质的保留时间有所改变）2、 定量分析（254nm）：由上述混合物定性分析实验
7、中可得，4.606min即苯峰的积分面积为237.380mAu*s,5.733min即萘峰的积分面积为702.335mAu*s,7.524min即菲峰的积分面积为866.522.进行面积归一化，Wi=fiAi/fiAi*100%由于还有未知杂质物质存在，不能确定计算各物质在实验体系中得质量分数，故混合物中三种物质的质量分数比为m苯：m萘：m菲=(1.00*237.380)：(0.08*702.335)：（0.01*866.522）=273.380:56.187:8.66532:7:13、 流动相组成对混合样保留时间的影响（254nm）表六： 梯度洗脱样品保留时间1/min2/min3/min梯
8、度条件14.6095.6156.819梯度条件24.6065.5766.666代表物质苯萘菲由实验所得数据可看出不同梯度条件下，同种物质的保留时间发生改变，在知道混合物大致组成及各物质的保留时间下，根据物质极性改变梯度条件可有效缩短试验时间及提高分离能力。实验中流动相随甲醇含量的增加，极性减小，两个梯度条件下，流动相极性减小越快，需要洗脱时间越短。六、 思考题：1、 反相色谱的基本规律是什么，为什么会有这样的规律？答：反相色谱的基本规律：待测样品中极性大的组分先被洗脱，即极性大的组分保留时间较短。原因：反相色谱流动相极性比固定相极性大，根据相似相容原理极性大的组分会先溶解到流动相中，极性小的后
9、溶解流动相中，故极性大的先被检测出，极性小的后被检测出，保留时间大。2、 反相色谱中流动相的组成对保留时间的影响如何？答：反相色谱主要分离非极性样品，极性强的先出柱，流动相中有机溶剂所占比例越大，（即极性越小），故根据相似相容原理样品在流动相中分配系数增大，故洗脱速率越大，保留时间越短。3、 在什么条件下可以用面积归一法作定量分析？有何优缺点？答：条件：样品中所有物质均能被检测出，且所有物质均能进行归属即每种组分均能分辨均能确定修正因子。优点：计算简单、定量结果与进样量无关，操作条件不需严格控制。缺点：不管试样中某组分是否需要测定，都必须全部分离流出并获得可测量的信号，且各物质校正因子应为已知（适用范围窄）。4、 梯度洗脱对样品分离有什么优点？答：优点：缩短分析周期、提高分离能力、峰型得到改善，很少拖尾、增加灵敏度。可以借助梯度洗脱将两个保留时间相近的物质的峰分开，从而使实验数据较为准确。