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1、Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是 聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“ 探针” 是抗体，“显色”用标记的二抗。探生网经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如
2、硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电 泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色 或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。二、试剂准备1. SDS-PAGE试剂:见电泳实验。2. 匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.0ml;10%SDS 6.0ml;-巯基乙醇 0.2ml;ddH2O 2.8ml。更多详情内容关注：3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g;Tris 5.8g;SDS 0.37g;
3、甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。4. 0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO4 1.44g;KH2PO4 0.24g;加ddH2O至1000ml。5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脱脂奶粉，现配)：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。6. 显色液：DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸镍胺 0.1ml;H2O2 1.0l。三、操作步骤1. 蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械
4、或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4，13,000g离心15min。取上清液作为样品。2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。3. 转移：(半干式转移) 电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min3次。膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。 转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压 500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋 白标
5、准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。四、免疫反应：1. 用0.01M PBS洗膜，5min 3次。2. 加入包被液，平稳摇动，室温2hr。3. 弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min3次。4. 加入一抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部)，4 放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。5. 弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min4次。6. 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释)，平稳摇动，室温2hr。7. 弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min4次。8. 加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。四、注意事项1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。3、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。