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1、药品微生物学检验技术第十二章 药品微生物检验方法验证的意及要求第一节 药品微生物检验结果的影响因素 微生物的生长受很多因素的影响，特别是药品中污染的微生物尤为如此。药品微生物检验是检测药品中具有繁殖能力的活细胞，这些活的微生物在药品中处于不稳定的状态，它的检出与否受很多因素的影响，主要影响因素有如下几点：一、 供试品组分由于供试品本身的特性，可能含有具有抑菌作用的组分成分，如抗生素中药中的黄莲、牛黄、冰片等。另外，很多供试品中加入的抑菌剂或防腐剂用于防止供试品中的微生物再污染和再生殖，以及增溶剂、乳化剂、抗氧剂等其他辅料，这些组分在一定浓度下对 微生物具有抑制作用，并可能对 药品中污染的微生物
2、造成不同程度的损伤。供试品中污染的微生物在这些物质的影响下有可能检不出，这时，它们虽然被 抑制甚至受到损伤，但并未死亡，在一定条件在塔门还可以稳定地存活一段时间，当微生物生存环境改变时，如抑菌成分消除或浓度降低时，这些微生物便可以复苏并繁殖，患者使用后同样可危及人体健康。对于这些药品，如按常规方法进行微生物检验，往往显示假阴性结果。除此之外，在药品微生物检验中，由于原料来源不同，特别是中药制剂，或者生产工艺的差别，使用的辅料不同等原因，使不同厂家生产的同一产品，甚至是同一厂家生产的同一产品不同批次的药品往往对同一中微生物的生长也有 不同程度的影响。 从理论上讲，许多药品含有影响微生物生长的物质
3、，许多试验也表明了这一点，表12-1列出了已知试验菌的菌数在不同药品中的回收率，有的药品几乎对所有试验菌均有很强的抑制或杀死作用。因此，供试品的组分及其浓度直接影响供试品中污染微生物的检查结果准确与否。表12-1 回收率小于70%样品的各试验菌回收试验结果样品名称回收率（%）控制菌检查方法大肠 金黄 铜绿 枯草 白色埃希菌 葡萄球菌 假单胞菌 芽孢杆菌 念珠菌金莲花胶囊感冒消炎片熊胆丸肿痛消擦剂-1 37.2 0 4.5 112.5 0 61.2 0 0 0 16.4 0 050.9 45.2 30.6常规法常规法离心法薄膜过滤法二、 微生物的多样性及复杂性自然界中微生物的种类和生存形式是多种
4、多样的，药品的种类繁多，剂型多样，其污染的微生物也是多样而复杂的，即使是同一产品的生产区域，所污染的微生物种类也不尽相同；同一产品因存放的时间和条件不同，其中污染微生物存在的形式可能改变（菌体或孢子等状态）。不同类型的微生物及不同的存活状态对环境的抗性是不同的，采用同一检查方法未必是适宜的。药品中污染的微生物，特别是生产前期污染的，受到原料处理、加工、加热等过程的影响，均可能受到一定程度的损伤。这些受损但尚存活的微生物可能遭受外界环境的抑制，只有在适宜的条件下使其修复或从抑制状态中复苏后，才能正常生长。否则，这些微生物就很难检出。三、 药品微生物的检查方法检查方法包括供试液制备方法和微生物检测
5、方法，它是保证检验结果准确可靠的最重要前提。 微生物检测时，首先进行供试液的制备，不同特性的供试品，应采用不同的供试液制备方法，如水溶性供试品直接加稀释剂制备即可；不溶水的固体供试品采用匀浆或加混悬剂制成均匀的混悬液；非水溶性油剂或软膏剂，因其与水难溶，使其中污染的微生物难与培养基接触或因缺氧而无法生长，需采用乳化剂使成均匀分散的乳浊液；有抑菌成分的供试品客加入消除抑菌成分的中和剂；离心沉淀及薄膜过滤消除抑菌成分的方法等，这些物理或化学的供试液制备方法在进行过程或多或少影响着供试品中微生物的回收。 同一份供试液采用不同的微生物检测方法，如常规法、培养基稀释法、薄膜过滤法、MPN法等，其检测的结
6、果可不同，因为其中所含的供试品浓度不同，特别是有抑菌作用的供试品。四、 检验条件药品中污染的微生物的检验是基于微生物在培养基中的生长情况进行结果判断。因此，培养基质量、PH、培养温度、培养时间及供氧情况等均影响微生物的生长，导致了检验结果的差异。除此之外，试验人员操作的误差，不同实验室的误差等原因，均可影响微生物的检出结果。第二节 药品微生物检验方法验证的意义及概况一、 药品微生物检验方法验证的意义正因为药品中污染的微生物检查结果受很多很多结果的影响，加上生物本身的误差就很大。这些将直接影响样品中微生物的回收（见表12-2），从表12-2看，试验样品中，试验菌的回收率小于10%、50%、70%
7、及80%的样品分别占25.3%、33.9%、35.5%及40.3%。试验结果表明了按现版的药典方法测定药品中污染的微生物，对有些样品来说，其结果不能真实反映样品的污染状况。在这种情况下，该方法也及时去其原有的意义。另外，任何检查法均有它的局限性，同一种供试品的微生物限度检查因采用的检查方法和检查条件不同，导致了不同的菌数测定结果，它将直接影响着检验结果的判定（见表12-3）。因此，在进行药品中微生物检验中，只有在各检测条件均适宜时，即在该检验条件下的样品浓度不足以抑制污染微生物的生长，使供试瓶中污染的微生物得以真实的反映，从而保证结果的哦科学性准确性。因此，其他分析方法一样，药品的无菌检查和微
8、生物限度检查也应证明所采用的方法是适宜的。确认所采用的方法适合于样品的微生物污染的检查，方可使用。表12-2 试验菌在样品中回收情况试验菌株试验样品1数回收率（%）占回收率小于70%的样品的比例1030507080大肠埃希菌15211 7.2%14 9.2%15 9.9%19 12.5%19 12.5%19/37(51.4%)金黄葡萄球菌18635 18.8%42 22.6%46 24.7%52 28.0%55 30.0%52/66(78.8%)铜绿假单胞菌933 3.2%55.4%77.5%1212.9%1415.0%12/29(41.4%)枯草芽孢杆菌9315 16.1%21 22.6%2
9、4 25.8%25 26.9%25 26.9%25/29(86.2%)白色念珠菌18625 13.4%25 13.4%29 15.6%33 17.7%35 18.8%33/66(50.0%)总计218647 25.3%55 29.6%63 33.9%66 35.5%75 40.3%注1：有的样品只测定部分试验菌株。注2：指各样品至少有一株的回收率规定。表12-3 同一样品不同检测方法的微生物回收率情况二、国外药典药品微生物检验方法验证的概况在美国药典、欧洲药典、日本药局对无菌检查法和微生物限度检查法协调之前，USP、BP、EP、JP对无菌检查法和微生物限度检查方法的验证要求提出要求。USP24版规定了在进行无菌检查和微生物限度检查时，应如何进行药物中微生物回收的验证试验，同时要求在检查时，应消除供试品的抑菌活性，以保证试验结果的可信性；USP24版的无菌检查法中还规定了无菌检车时应进行样品的抑细菌、抑真菌试验。BP1993版无菌检查法中虽未单列抑细菌、抑真菌试验，但在培养基促生长试验中含有加供试品组以观察供试品是否含有抑菌活性，事实上是培养基促生长试验与抑细菌、抑真菌试验同时进行；BP1998版就比较详细的规定应如何及何时进行药品无菌检验法的验证，在微生物限度检查法中也同时要求应进行培养基质量和检查方法的确认。