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1、实验四 酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素一、实验目的了解ELISA的基本原理，及其优缺点； 掌握间接ELISA法的试验操作过程。二、实验原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是免疫酶技术的一种。本方法测定的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的特异性单克隆抗体，加入黄曲霉毒素标准品（或样品溶液）及黄曲霉毒素B1 酶标记物，标准品（或样品溶液）中的游离黄曲霉毒素B1 与黄曲霉毒素B1酶标记物竞争黄曲霉毒素B1 抗体，没有连接抗体的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将基质/发色剂加入到孔
2、中并且孵育，结合的酶标记物将基质/发色剂转化为蓝色的产物，加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色，在450nm 处测量，吸收光强度与样品中黄曲霉毒素B1的浓度呈负相关。三、实验器材1、ELISA试剂盒其组成如下：1.1 包被抗体的反应板 48孔1.2 A试剂：样品稀释液 l瓶1.3 B试剂：AFB1标准溶液 l套(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 ng/mL)1.4 C试剂：酶标抗原 l瓶1.5 D试剂：酶标抗原稀释液 l瓶1.6 E试剂：浓缩洗涤液 l瓶1.7 F试剂：显色底物液a l瓶1.8 G试剂：显色底物液b l瓶1.9 H试剂：终止液 l瓶1.10 反应板框架 l块2、仪
3、器1.1 酶标仪(内置450nm滤光片)1.2 50L微量移液器及配套吸头1.3 恒温培养箱(0-50)1.4 冰箱(4-8)1.5 感量0.0lg的天平1.6 调速振荡器或超声波清洗器1.7 离心机5000r/min1.7 玻璃器皿：具塞锥形瓶，烧杯，分液漏斗，普通漏斗，量筒，具塞试管，滴管，移液管等1.8 小型粉碎机或碾钵1.9 其它：滤纸，吸水纸等四、实验步骤1、实验准备1.1 样品处理：详见试剂盒说明书所列“样品处理方法”及“黄曲霉毒素国家允许量标准及样品稀释表” 1.1.1 脂肪含量小的固体样品(如大米、玉米、小米等) 称取5.0g样品(已粉碎)于100mL具塞三角瓶中，准确加入25
4、.00mL甲醇水(1+1)溶液，于振荡器上剧烈震荡15min，过滤，弃去l/4初滤液，收集试样滤液，此液为样品提取液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂(样品稀释液)将样品提取液进行适当稀释（如100L样品提取液+100L样品稀释液，总稀释10倍），即为待测样液。1.1.2 花生 样品去皮粉碎(刀切或剪切)，称取5.0g于100mL具塞三角瓶中。加入25.0mL甲醇水(1+1)溶液和20mL正已烷(或石油醚)，于振荡器上剧烈震荡l0min，过滤于分液漏斗中，静置分层，放出下层甲醇水提取液，此液为样品提取液，根据样品的国家允许量标准，用A试剂(样品稀释液)将提取液进行适当稀释（如100L样品提取
5、液+300L样品稀释液，总稀释20倍），即为待测样液。1.1.3 一般饲料及原料 称取5.0g样品于100mL具塞三角瓶中，准确加入25.0mL甲醇水(1+1)溶液，于振荡器上剧烈震荡15min，过滤，弃去1/4初滤液后收集滤液，此液为样品提取液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂(样品稀释液)将样品提取液进行适当稀释（如100L样品提取液+900L样品稀释液，总稀释50倍），即为待测样液。1.2 试剂的配制1.2.1每瓶C试剂（酶标抗原）中准确加入1.5mL D试剂(酶标抗原稀释液)，充分溶解，配成实验用酶标抗原溶液，28保存。1.2.2 取适量E试剂(浓缩洗涤液)用超纯水稀释20倍待用。例
6、如：取3mL E试剂(浓缩洗涤液)，加57mL超纯水，混匀后制成实验用洗涤液，足够24孔使用。2、操作步骤2.1 试剂平衡：将测试盒于室温中放置15min以上，平衡至室温。2.2 小孔编号：根据实验需要截取相应孔数放置反应板框架上。设定l号孔为仪器调零孔，2-7号孔为AFB1标准对照孔，其余孔为样品孔。2.3 洗涤：每孔加入250L左右洗涤液，洗涤液不得溢出，放置1min后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板一次。2.4 反应组成：按下列步骤所示（见表1），依次加入配制好的溶液及待测样液。 第一步：l号孔加入50L A试剂(样品稀释液)，2-7号孔分别加入系列的B试剂(AFB1标准溶液：0，
7、0.1，0.25，0.5，1，2ng/mL) 50L，其余孔加入相应的待测样液。 第二步：l号孔加入50L D试剂(酶标抗原稀释液)，其余各孔均加入50L C试剂（酶标抗原溶液）。 第三步：轻轻地振摇，使各孔中的反应物混合均匀。 表1 反应物组成操作次序加入量孔 号123456789101112150 LA00.10.250.512待测样液250 LDCCCCCCCCCCC3混 匀2.5 反应：将反应板放入37恒温培养箱中孵育30min。2.6 洗涤：取出反应板，用力甩掉反应液，拍干。每孔加入250L左右洗涤液，洗涤液不得溢出，放置2min后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次。2.7
8、显色：每孔分别加入F试剂(显色底物液a)和G试剂(显色底物液b)各50L，摇匀，将反应板放入37恒温培养箱中显色15min。2.8 终止与仪器测定：每孔分别加入H试剂（终止液)50L，摇匀后用酶标测定仪在450nm波长处测定各孔的吸光度A值。3、试样测定与结果计算将系列AFB1标准溶液(0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/mL)测得的吸光度A值，绘制成标准曲线(见示意图)。横坐标为标准液浓度的常用对数值(1gC)，纵坐标为各标准液孔A值与0ng/mL标准液孔的A值的比值(A（标准液）A（0ng/mL）（若同时有平行实验数据，则A及A0分别取其平均值，下同）。黄曲霉毒素B 1标准曲线示意图(注：仅供参考)计算待测样品孔A值与A(0ng/mL)的比值(A样品/A（0ng/mL）)，查标准曲线，可得到相应待测样液浓度(C)的常用对数值lgC，对其求反对数，可求得待测样液的AFB1浓度C。按下列公式计算出样品中AFB1的含量：式中： C：待测样液中AFB1含量(ng/mL)V：样品提取液体积(mL)m：样品质量(g)D：样品稀释倍数五、思考题1、ELISA实验过程中，洗板的目的是什么？2、如出现标准品无颜色变化或者无序混乱，试分析其可能的原因。