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1、基础研究自体窦房结细胞异位移植治疗缓慢型心律失常的实验研究张浩 宋智钢 段炼 姚颖龙 邹毅清 宗刚军 徐志云 摘要 目的 探索自体窦房结细胞异位移植，构建心室异位起搏灶治疗缓慢型心律失常的可行性。 方法 将健康成年犬16只随机分为移植组和对照组（每组8只）。移植组切取窦房结组织并制成细胞悬液后，注射到自体右心室近心尖部心肌内，对照组切取窦房结后,于右心室相同部位注射等量培养液。2周后建立完全性房室传导阻滞动物模型并进行电生理检查。对移植组犬经股静脉注射异丙肾上腺素和阿托品，研究心率变化。免疫荧光染色观察移植的细胞存活状况及其与心室肌细胞形成的缝隙连接结构。 结果 消化分离成年犬窦房结得到的自主
2、搏动的细胞结构和活性保持良好。建立完全性房室传导阻滞模型1 h后，移植组犬心率(9114)次/min高于对照组(4911)次/min(t=6.672，P0.01)，且此室性心律起源于细胞移植部位。注射异丙肾上腺素后，移植组室性心率由(9511)次/min增加至(11815)次/min(t=3.497，P0.05）。免疫荧光染色法证实，移植的细胞在移植部位存活，且细胞间有缝隙连接蛋白形成。 结论 成年犬窦房结细胞移植到自体右心室壁，能够提高完全性房室传导阻滞后的心室率，且对异丙肾上腺素反应良好，对阿托品无明显反应。移植的细胞可与周围细胞形成缝隙连接。关键词 窦房结；细胞移植；移植，自体；心动过缓
3、Experimental research of autologous sinoatrial node cells heterotopic transplantation for treating bradycardia ZHANG Hao*, SONG Zhi-Gang, DUAN Lian, YAO Ying-long, ZOU Yi-Qing, ZONG Gang-Jun, XU Zhi-Yun. *Department of Cardiothoracic Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Sh
4、anghai 200433, ChinaCorresponding author：XU Zhi-YunAbstract Objective To explore the feasibility of autografting sinoatrial nodal cells to construct an ectopia pacemaker for treating bradycardia. Methods Sixteen healthy adult dogs were involved in our study. The dogs were randomly assigned to graft
5、group or control group (n1=n2=8). The sinoatrial node (SAN) from dogs in graft group was harvested and digested into cell suspension in vitro, then injected to autogenic right ventricular wall adjacent to heart apex. Commensurable culture medium was injected to the same position with the dogs in con
6、trol group. Objective Two week later, all dogs underwent transcatheter ablation of His bundle to create a complete heart block model and an electrophysiology study was carried out. For investigating the change of the rhythm, isoproterenol and atropine was injected to dogs of graft group respectively
7、. Immunofluorescence stained was used to investigate the survival of grafted cells and gap junction formed between grafted cells and ventricular myocytes. Results The isolated cells from SAN were retained active and beating. After ablation, higher heart rates were observed in dogs of graft group(911
8、4)bpm,n=8 than that of control group(4911)bpm,n=6(t=6.059, P0.01), and these ventricular rhythms originated from cell transplant sites. These rhythms increased obviously with isoproterenol from (9511)bpm,n=8 to (11815)bpm,n=8 (t=5.218，P0.05). Immunofluorescence stained suggested that the grafted SAN
9、 cells survived in ventricular myocardium and connexins expressed between cells. Conclusion SAN cells from adult dogs autografted into the right ventricular wall can boost the ventricular rhythm of complete heart block. And this rhythm is sensitive to isoproterenol, while no sensitivity to atropine.
10、 Grafted SAN cells can form gap junctions with adjacent myocytes. Key words Sinoatrial node; Cell transplantation; Transplantation, autologous; Bradycardia严重的缓慢型心律失常由于心室率减慢导致心输出量减少而出现心功能不全表现，甚至发生晕厥、猝死。因此，这类患者往往需要永久电子心脏起搏器的植入治疗1。我们尝试利用细胞移植技术，以完全性房室传导阻滞犬模型为研究对象，将自体窦房结移植到下位心肌内以达到重建心脏异位起搏灶的目的，探索治疗此类疾病的新
11、方法。材料与方法1. 动物与试剂：健康成年杂种犬16只，11.5岁龄，雌雄不限，质量1520 kg，购自第二军医大学实验动物中心。将实验动物随机分为移植组和对照组，每组8只。弹性蛋白酶（德国Roche公司）、胶原酶型、透明质酸酶（美国Worthington公司）、嗜热菌蛋白酶（美国Sigma-Aldrich公司），M199培养液(美国GIBCO公司)。2. 安置临时心外膜起搏导线：将实验犬均给予肌注氯胺酮（10 mg/kg）后行气管插管，丙泊酚、芬太尼、哌库溴胺维持麻醉，经第4肋间右前外侧切口进胸，悬吊心包，安置心外膜起搏导线，连接至体外临时心脏起搏器。3. 窦房结组织的定位及取材：牵引右心耳
12、，使用Lead2000多道电生理记录仪，将心外膜标测电极置于上腔静脉与右心耳交界处的外侧，即界沟起始部，标测最早激动点（该点心外膜标测到的QRS波比体表心电图QRS波提前10 ms左右），用5-0 Prolene线缝于该点并牵引，用心耳钳沿界沟方向以该点为中心钳夹15 mm10 mm组织，立即用圆刀片沿心耳钳切取，并移入4 的心肌保护液中，转移至超净台内。获取窦房结后体表心电图显示两组犬心律为房室结逸搏心律或窦性心律，启用心外膜起搏器，起搏模式设为心室起搏（VVI），起搏频率100 次/min。采用褥式缝合技术缝合心房切口，术野止血后以盐水纱布覆盖胸壁切口。4. 窦房结细胞的消化分离：将窦房结
13、组织移入无钙台氏液（NaCl 140 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，MgCl2 1 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，HEPES 5 mmol/L，pH 7.4）中洗去血凝块，并用眼科剪将组织剪碎，漂洗后移入含有0.1 g/L弹性蛋白酶、400 U/ml胶原酶型、10 U/ml嗜热菌蛋白酶、3.5 U/ml透明质酸酶的无钙台氏液中，37 消化约50 min（每10 min吹打1次），自然沉淀后弃上清。再加入无钙台氏液，离心后弃上清。加入无血清M199培养液制成细胞密度为23105/ml的细胞悬液，以备细胞移植。将40 g/L的锥虫蓝溶液与细胞悬液按照1 : 9混匀后染色，3
14、 min后用红细胞计数板计数活细胞和死细胞，计算活细胞率。5. 分离细胞的荧光标记2：向沉淀中加入无钙台氏液，再加入0.2 g/L的4,6-脒基-2-茚二酮(DAPI)于35 水浴孵育30 min。用无钙台氏液漂洗以去除未结合的DAPI。离心后收集沉淀细胞，加入无血清M199培养液制成细胞密度为23109/L的细胞悬液。6. 窦房结细胞自体移植：对两组动物均使用5-0 Prolene线将钛夹缝合至拟注射区作为X线标记。对移植组犬，将0.5 ml窦房结细胞悬液经自制的心肌内细胞注射器，斜行注入钛夹标记下方5 mm右心室近心尖部心外膜下5 mm处。对照组于相同部位以等量的M199培养液注射。彻底止
15、血后逐层关胸，应用抗生素预防感染。使用弹力绷带固定临时心脏起搏器于犬背部。7. 建立完全性房室传导阻滞模型与电生理检查：细胞移植2周后氯胺酮和安定麻醉动物，参照Ruhparwar等3的方法，分离并穿刺右侧股静脉，经8 F动脉鞘将7 F可操控四极大头电极送至右心房，停用起搏器（7 F标测电极送至右心室）。标测定位并射频消融希氏束，建立完全性房室传导阻滞犬模型。行常规6导联体表心电图记录心律变化。对细胞移植区(钛夹标记处) 应用大头电极进行心内起搏标测以判断室性自主心律是否起源于细胞移植部位。模型建立后第7天和第14天对所有存活犬行6导联常规体表心电图检查。8. 神经递质对室性心律的影响：建立完全
16、性房室传导阻滞模型当天，对移植组出现室性自主心律的犬，经股静脉注射异丙肾上腺素（2 g/min），1 h后静脉注射阿托品（0.5 mg），观察并记录心率变化情况。9. 免疫荧光组织化学分析：于建立模型后第14天，对移植组犬应用氯胺酮和丙泊酚麻醉后快速静脉注射10氯化钾，心脏停跳后速取心脏，获取细胞移植部位心室肌进行冰冻切片并经丙酮固定后，采用双重免疫荧光染色法对切片染色：PBS液漂洗后小牛血清封闭10 min，加入兔抗连接蛋白43 (Connexin-43) 抗体（1 : 50，武汉博士德公司）于室温下孵育60 min，再用异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔IgG(美国Santa Cruz公司)室温下
17、孵育10 min。PBS冲洗3次后加入小鼠抗肌小节肌动蛋白(-sarcomeric actin)抗体(1 : 100，武汉博士德公司)，室温下孵育60 min，再用藻红蛋白标记的羊抗小鼠IgG（美国Santa Cruz公司）室温下孵育10 min。50%缓冲甘油封片，荧光显微镜（IX70，Olympus）下观察结果。分别设立标本自发荧光对照和阳性对照，以排除非特异性染色。10. 统计学分析：所得计量资料数据以s表示，组间比较采用成组t检验。对出现室性自主心律的移植组犬，采用配对t检验比较移植组应用异丙肾上腺素和阿托品前后的心率变化。采用SAS 9.0统计软件处理数据。结 果1. 分离细胞的形态
18、学观察及细胞活性：对用酶消化法分离获得的犬窦房结细胞进行形态学观察（图1），倒置显微镜下可见自主搏动较快的细胞主要为长梭形和球形，边缘清楚，胞质清亮，自发性搏动的频率较快。镜下也可见呈部分杆状的心房肌细胞，胞质丰富，透光性差，可见清楚的横纹，搏动频率慢但收缩有力。DAPI标记细胞核后，于荧光显微镜下，激发光波长为360 nm时可以观察到分离细胞的细胞核呈现明亮的蓝色荧光。经锥虫蓝染色，计算活细胞率为80%以上。2. 完全性房室传导阻滞犬模型的建立：细胞移植2周后，移植组与对照组动物均存活。将7 F可操控四极大头电极送入右心房，置于三尖瓣环口并贴近房间隔，在记录到希氏束电位波（H波）后，于该处放
19、电（3040 W），体表心电图显示P波与QRS波完全分离，心房率快于心室率，认为模型建立成功。3. 电生理检查：建立完全性房室传导阻滞犬模型后，心外膜起搏器的起搏频率设为80 次/min，移植组510 min内犬均可见室性自主心律的QRS波夺获心室，对照组未出现。30 min后，室性自主心律为（9517）次/min，对照组全部为起搏心律80次/min。1 h后停用起搏器，移植组犬心率为（9114）次/min，对照组犬中2例由于心率过慢出现室颤而迅速死亡，6只呈缓慢的完全性房室传导阻滞心电图波形(4911)次/min，移植组犬心率高于对照组（t=6.672，P0.01）。对移植组犬，使用7 F可
20、操控标测电极于细胞移植部位（钛夹标记下方5 mm），行右心室心内膜起搏标测，可以得到与体表心电图各导联相同的QRS波形，心内膜激动标测最早激动点QRS波群比体表心电图提前约10 ms，证实此室性心律起源于细胞移植部位。4. 对神经递质的反应：对移植组出现室性自主心律的犬，经股静脉注射异丙肾上腺素（ISO）后，犬心率由(9511)次/min增加至(11815)次/min (t=3.497，P0.05）。5. 近期效果观察：对照组犬在模型建立后，停用起搏器当天全部死亡，而移植组犬中除1只于第2天死亡外，其余7只犬于观测期内（2周）均存活，模型建立后第7天和第14天氯胺酮麻醉动物，行6导联常规体表心
21、电图检查，两次平均室性心率为(10712)次/min（第7天）和(987)次/min（第14天），与模型建立当天(9511)次/min相比，差异均无统计学意义（t值分别为2.085、0.651，均P0.05）。6. 免疫荧光组织化学染色：获取移植组犬细胞移植部位的心室肌标本，在荧光显微镜下观察可见，移植的窦房结细胞(DAPI和PE标记)之间，以及移植细胞与原有心室肌细胞(只有PE标记)之间均有缝隙连接蛋白43（Connexin-43）的表达（FITC标记），这提示移植细胞之间以及移植细胞与原有心室肌细胞之间均可能有电-机械耦联形成（图2）。讨 论目前对于严重缓慢型心律失常的主要治疗是植入永久电
22、子心脏起搏器，近年来国外有学者使用干细胞构建生物起搏器4-6，以治疗各类缓慢型心律失常，如胚胎干细胞和成人骨髓间充质干细胞等，为这类疾病的治疗开拓了全新的思路。但由于干细胞存在免疫排斥、分化调控、肿瘤形成等问题，甚至导致严重心律失常7等，严重制约了其移植后起搏心脏的功能。国内李继文等8采用基因技术改变乳鼠心肌细胞的电生理特性，使其具有一定的起搏功能，但仍不能完全模拟天然的起搏细胞。本研究中，我们直接采用天然的起搏细胞-窦房结细胞进行自体移植，以探寻一种更为理想的、不受以上问题制约的移植细胞，并研究这一方法治疗缓慢型心律失常的作用和效果。本实验的关键是窦房结细胞的准确定位和保持消化的窦房结细胞的
23、良好活性。我们在解剖学定位的基础上，结合电生理标测定位的方法，以保证窦房结定位的准确性。根据成年动物窦房结内胶原含量高的特点，并借鉴神经组织和结缔组织的消化方法，我们联合使用弹性蛋白酶、胶原酶型、嗜热菌蛋白酶以及透明质酸酶等4种酶，并摸索出较为合适的消化条件，获得的细胞结构和功能保持完整。由于窦房结组织结构致密，起搏细胞、心房肌细胞以及成纤维细胞等紧密连接，而本实验的目的在于初步探讨这一方法的可行性，因此未对所得细胞进行纯化分离而直接进行自体移植。为便于手术操作，我们将成年犬窦房结细胞移植到自体右心室近心尖部心肌内，在射频消融希氏束建立完全性房室传导阻滞模型后，移植组的室性自主心律的节律明显高
24、于对照组，并且这一室性心律起源于细胞移植部位，这提示通过本方法，使窦房结细胞下移到心室后，能在心室肌内形成新的异位起搏灶，并可以驱动心室而显著提高心室率。人工心脏起搏器缺乏对神经体液调节的反应性，而利用细胞移植技术构建的生物起搏器却可以具备这一优势9。我们在研究中也进行了以异丙肾上腺素和阿托品作为调节剂进行了相关测试。结果显示移植组心律对异丙肾上腺素调节作用反应敏感，这提示移植细胞对于神经体液的调节具有良好的反应性。而阿托品作为一种通过抑制迷走神经提高心率的胆碱能拮抗剂，对于没有神经支配的位于心室肌内的窦房结细胞难以发生作用，因而导致这种室性心律对于阿托品的这种正时效应无明显反应。我们通过双重
25、免疫荧光染色技术证实，移植的窦房结细胞能够在注射部位存活，且移植的细胞之间以及移植细胞与原有心室肌细胞之间均可观察到缝隙连接蛋白Connexin-43表达，这提示将自体窦房结细胞移植到心室肌后，能够与周围心肌细胞形成电-机械耦联，使窦房结细胞产生的电冲动信号向周围心肌扩布，从而使心室产生同步性收缩运动10。总之，应用自体窦房结细胞进行异位移植治疗缓慢型心律失常具有较好的可行性和较高的研究价值。尽管如此，由于酶消化窦房结以及细胞移植的过程本身对于窦房结细胞仍具有一定的损伤，因而移植后窦房结细胞的远期存活问题，仍有待于进一步的研究证实。参考文献1 Bonatti V, Agnetti A, Squ
26、arcia U. Early and late postoperative complete heart block in pediatric patients submitted open-heart surgery for congenital heart disease. Pediatr Med Chir, 1998, 20:181-186.2 Rye HS, Glazer AN. Interaction of dimeric intercalating dyes with single-stranded DNA. Nucleic Acids Res, 1995, 23:1215-122
27、2.3 Ruhparwar A, Tebbenjohanns J, Niehaus M, et al. Transplanted fetal cardiomyocytes as cardiac pacemaker. Eur J Cardiothorac Surg, 2002, 21:853-857.4 Xue T, Cho HC, Akar FG, et al. Functional integration of electrically active cardiac derivatives from genetically engineered human embryonic stem ce
28、lls with quiescent recipient ventricular cardiomyocytes: insights into the development of cell-based pacemakers. Circulation, 2005, 111:11-20.5 Kolossov E, Lu Z, Drobinskaya I, et al. Identification and characterization of embryonic stem cell-derived pacemaker and atrial cardiomyocytes. FASEB J, 200
29、5, 19:577-579.6 Valiunas V, Doronin S, Valiuniene L, et al. Human mesenchymal stem cells make cardiac connexins and form functional gap junctions. J Physiol, 2004, 555:617-626.7 Zhang YM, Hartzell C, Narlow M, et al. Stem cell-derived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential. Circulation, 200
30、2, 106:1294-1299.8 李继文, 郭继鸿, 张萍, 等. 腺病毒介导超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型4过度表达对乳鼠心肌细胞电生理特性的影响. 中华医学杂志, 2006, 86:1332-1336.9 Potapova I, Plotnikov A, Lu Z, et al. Human mesenchymal stem cells as a gene delivery system to create cardiac pacemakers. Circ Res, 2004, 94:952-959.10 Rubart M, Pasumarthi KB, Nakajima H
31、, et al. Physiological coupling of donor and host cardiomyocytes after cellular transplantation. Circ Res, 2003, 92:1217-1224.基金项目：国家自然科学基金资助项目(30672075，30700157)作者单位：200433上海，第二军医大学附属长海医院胸心外科（张浩、宋智钢、 段炼、姚颖龙、徐志云），麻醉科（邹毅清），心内科（宗刚军）（收稿日期：2007-03-12）（本文编辑：吕小东）ABC图1 消化窦房结组织所得的三种细胞 图1A.长梭形细胞，图1B.球形细胞，图1C.杆状细胞 倒置显微镜 400ABC图2 荧光显微镜下观察移植组细胞移植部位心室肌标本 图2A. 激发光波长为405nm，图2B. 激发光波长为490 nm，图2C. A与B重叠显影；抗肌小节肌动蛋白为红色荧光，抗连接蛋白43为黄绿色荧光，DAPI标记的细胞核为蓝色荧光 400