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1、 皮肤细胞培养影响因素的探究陕西师范大学 朱影，张瑞，李晓，张晓，张秀秀（1.朱影 陕西师范大学 理工科基础教学部 陕西省 西安市 710062；2. 张瑞 张晓 张秀秀 李晓 陕西师范大学 理工科基础教学部 陕西省 西安市 710062；）指导老师：吴民耀 副教授【摘要】：近年来,随着成体干细胞研究的不断深入,人们己能在体外分离纯化、鉴别,扩增和培养多种组织干细胞,其中包括从皮肤表皮基底层分离的表皮干细胞、以及从毛囊隆突处分离的毛囊干细胞等皮肤类干细胞。皮肤类干细胞具慢周期、聚集性的特点,能维持和修复皮肤组织损伤的功能。然而影响干细胞培养的因素很多，本实验分别从不同消毒处理对细胞培养的影响、
2、不同培养基对细胞培养的影响、不同血清浓度对细胞培养的影响等方面对影响干细胞培养的多个因素进行了探究。【关键词】：大鲵 干细胞 培养1.皮肤类干细胞的来源 目前,上皮干细胞、表皮干细胞,角质化细胞,角阮干细胞,皮肤类干细胞,皮肤类干细胞,毛囊干细胞(英文名称主要有Epidermal stem cell、Keratinize stem cell、Skin Stem cell及Hair follicle stem cell)等虽然名称不一,但都源于皮肤组织,所以我们将其统称为皮肤类干细胞。对于皮肤类干细胞的来源,科学家们从各自的实验证据提出了不同的观点:一种认为毛囊处存在可供毛囊再发生的干细胞,在很
3、长一段时间内,毛球部区域被认为是毛囊干细胞存在的部位,但近年来又有人提出“隆突激活假说”,认为毛囊上皮干细胞位于毛囊外根鞘部的隆突部。Taylor等认为毛囊是角阮干细胞(keratinize stem cell)主要来源,毛囊干细胞不仅能形成毛发,而且可以形成表 皮。Oshima等指出,存在于小鼠触须毛囊外根鞘部的多能干细胞能分化产生构建表皮、皮脂腺和毛囊等所需的各种类型的细胞。另一种观点认为,哺乳动物及人的表皮基底层细胞具有干细胞特性。20世纪70年代末提出的“表皮增殖单位”学说认为,构成表皮细胞柱基底层有810个有分裂能力的细胞,其中央有一个原始干细胞,由这个干细胞产生这个柱的所有细胞。B
4、ickenbach(1981)首次利用3H一TdR标记了鼠皮肤中的这种细胞,证明这种细胞是一种细胞标记滞留细胞,在体内表现为慢周期性,这一传统的标记方法一直被研究毛囊干细胞和表皮干细胞的学者应用。Slacken以为成年哺乳动物及人类上皮组织中均有多能干细胞存在。关于毛囊千细胞与表皮干细胞是否同源是近年来科学家们所关注的焦点。Laver等指出,毛囊和表皮两种结构中只有一种根本的表皮干细胞,它具有形成皮肤和毛发的功能。因没有系统的鉴定方法,还不能明确指出这类干细胞的确切来源。2. 皮肤类干细胞的生物学特性目前研究较为深入的皮肤类干细胞是表皮干细胞。根据细胞的不同分裂增殖能力.表皮干细胞存在三种状态
5、:干细胞(keratinocyte stem cell KSC)、短暂扩增细胞(transit ampilifying cell TA细胞)和分化细胞(postmitotic differentiating cell PMD细胞)。干细胞属于不对称分裂细胞,具有无限增殖分化能力;短暂扩增细胞是干细胞的子细胞,经过几代分裂后便形成分化细胞;分化细胞属成熟细胞。正常情况下,每肴、表皮千细胞进行不对称分裂,产生干细胞和短暂扩增细胞,维持皮肤的正常功能。于细胞、短暂扩增细胞和终末分化细胞分布于表皮不同的空间结构中,形成一定的空间结构,称为表皮增殖单位(Epidermal proliferation u
6、nit EPU)并呈现出一定的梯度变化,即表皮干细胞一TA细胞一终末分化细胞。在表皮组织受损伤时,干细胞则可对称分裂,分裂一次可产生两个干细胞或两个祖细胞,从而可大量增加干细胞以及分化细胞的数量,更好地适应机体的需要。表皮干细胞具有两个明显的特征:慢周期性和高度的增殖潜能。慢周期性体现在进行体内细胞周期标记试验时表现为标记物保留细胞LRCS,增殖潜性能则体现为体外培养时呈克隆性生长。在显微镜下,表皮干细胞形态较为原始,体积小,核大,核浆比例大,用流式细胞仪分析,体内的表皮干细胞多处于G0G1期,其分裂增殖活动相对静止。在活体内注射H3标记的脱氧胸普或澳化脱氧尿普后,其标记可在表皮干细胞中长期保
7、持不变,而其他如TA细胞等随着细胞的不断分裂增殖其标记很快被稀释并逐渐消失。表皮干细胞的另外一个特点是对基底膜具有茹附性。在体内,表皮下细胞在整合素、连接素等表面茹附因子的介导下通过半桥粒茹附在基底膜上,离体只,大多数表皮干细胞在10min之内即勃附到胶原等细胞外基质上,而大多数TA细胞的勃附则发生在20一60min,所以可以根据干细胞的豁附性来进行鉴定。表皮干细胞相对数量很少,Kolodka等研究表明,人和鼠的皮肤中,约有10%的基底层细胞为表皮干细胞。但最近的研究表明将能快速粘附到型胶原上的10%的基底细胞仅仅有40%的细胞可以形成大克隆,表明基底细胞中仅有4%为表皮干细胞。表皮干细胞属于
8、全克隆细胞,在组织损伤或体外培养等条件下表现出持久的增殖能力和强大的克隆形成能力,一个干细胞形成的克隆细胞数可达5000以上,而TA细胞则为部分克隆细胞,多数TA细胞克隆数少于32个细胞。表皮干细胞形成的克隆明显大于短暂扩增细胞的克隆。在体内呈慢周期性,体外培养呈克隆性生长是分离鉴定皮肤类干细胞的最经典的方法,一直沿用至今。 3、不同消毒处理对细胞培养的影响皮肤直接与外界接触,一般在野外进行采样,易污染;加之一般是活体采样,对象多为 育种价值高或珍贵稀有的动物,为了减少采样造成的应激、降低对其健康状况和应用 价值的影响,所取的组织块都很小;所以为了提高培养的成功率,一般采用组织块法进行原代培养
9、。本试验以小鼠尾尖皮肤组织为研究对象作为预实验，比较不同消毒处理及培养方法的优缺点,选择合适的消毒处理及培养方法。以免消毒处理不当，对珍贵的大鲵皮肤实验材料造成浪费。3.1试剂OEME(高糖);新生牛血清(NCS);0.25%胰蛋白酶;0.1%胶原酶;1%新洁尔灭;1新洁尔灭;75%乙醇;70%乙醇;乙醚;双抗:青霉素8104IUml -1链霉素1105 IUml -13.2试验方法采样前的消毒处理:用乙醚将小鼠进行麻醉后,用清水擦洗尾部并刮毛后,采用75%乙醇或l%新洁尔灭溶液擦洗多次,然后进行碘酒消毒、75%乙醇脱碘。采样用无菌剪刀剪断鼠尾,置无菌培养皿中,转移至无菌操作台上。采样后的消毒
10、处理在无菌操作台上,进行消毒处理,主要方法有:A.70%乙醉浸泡30s;B.70%乙醇浸泡5min;C 1.新洁尔灭浸泡5min;D.双抗浸泡10min。接种培养消毒处理后,用PBS洗涤45次,将皮肤与软骨分离开,将皮肤组织剪成约1mm3的小块,自然沉降洗涤2次,然后进行组织块培养,观察消毒效果。表1不同消毒效果的无菌效果比较Comparison of asepsis effect of different disinfectant methods组别Group消毒处理Disinfectant methods消毒效果Effect of disinfection洗涤Washing浸泡Marina
11、te浸泡时间Time of marinate感染Infection无菌Disfection细胞生长情况Grouth of cell175%乙醇75%乙醇30s5min5111无细胞长出无细胞长出275%乙醇1%新洁尔灭5min3无细胞长出375%乙醇双抗10min2有细胞长出但生长不良41%新洁尔灭1%新洁尔灭5min4生长良好51%新洁尔灭双抗10min7生长良好 3.3不同消毒处理的效果从表可见联合使用乙醇与碘酒、双抗的消毒效果不理想,消毒不彻底或细胞生长不良;新洁尔灭与碘酒、双抗联合使用的消毒效果比较好,消毒彻底,且细胞生长良好,对时间要求不严格,操作简单方便。要配制不同抗生素含量的PB
12、S,在洗涤皮肤组织块时也需要不停更换PBS,操作比较繁琐。本试验结果表明,采用高浓度双抗浸泡10而n或1%o新洁尔灭浸泡5min,均能达到较好的消毒效果,且对细胞的损伤较小,细胞生长良好。该消毒方法能克服乙醇浸泡对时间要求的紧迫性,简化了操作步骤,又可省去配制和使用含不同抗生素浓度的PBS的繁琐,值得推广和应用。 4四种不同培养基对细胞的影响用四种不同的基本培养液培养细胞,在培养的第6天消化收集细胞进行计数,培养液准备根据试验用四蒸水配制以下培养液I:TCM199+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素+100IU/ml两性霉素;11:DMEM+100IU/ml青霉素+100IU/ml
13、链霉素+100IU/ml两霉素;111:DMEM/F12+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素+100IU/ml两性霉素;IV:Fl2+100IU/青霉素+100IU/ml链霉素+100IU/ml两性霉素。取第四代长成单层的细胞用消化液消化后,将细胞悬液分为相同的I、IV四个部分,分别离心10min,弃去上清液。四部分分别用基本培养液I、调整浓度为4x104 cellsml-1。接种24孔培养板,每孔1mL,共接三孔,37，5CO，饱和湿度下静置培养,24h后分别换与原接种培养液相同的培养液一次,以后每两天换液一次,于培养的第六天收集细胞进行计数。表2基础培养液TCM199DMEMD
14、MEM/F12F12计数器117.0819.517.1016.05计数器216.9519.8516.8015.90计数器317.2019.2916.7515.98接种细胞数(D0)2.452.452.452.45群体倍增值（X）2.8572.9972.7852.7065.血清浓度对细胞生长的影响在添加5mM Hepes的DMEM基本培养液中,分别添加10、15、20的胎鼠血清,分组培养纯化皮肤成纤维细胞。培养的第六天,用台盼蓝染色,在血球计数板上进行细胞计数,以各组细胞的平均值评估其作用。以低糖DMEM为基本培养液,在添加血清、Hepes的同时添加不同剂量的EGF、IGF一l,分组培养,在培养
15、的第六天各取三瓶进行计数,以细胞生长倍增值为准,评估生物活性因子对皮肤成纤维细胞生长的影响。以DMEM为基础培养液,分别添加不同浓度的血清,培养皮肤成纤维细胞,培养后第6天进行细胞计数,结果表明,添加10%,15%,20%FCS对细胞生长的影响是,随着血清浓度升高细胞生长呈渐增趋势,但无显著差别(P0.05)。6、EGF、IGF-1对细胞生长的影响以低糖DMEM为基本的培养液,在添加血清、双抗和Hepes的同时分别添加不同剂量的EGF、IGF-1分组培养,在培养第六天各取三瓶进行计数,以细胞生长群体倍增殖为准,评估生物活性因子对皮肤成纤维细胞生长的影响。结果表明EGF和IGF-1对细胞生长均有
16、明显促进效果(b:a p0.05;e:a,p0.05),其中IGF-1的促生长作用强于EGF,且EGF与IGF-1具有协同作用(d:cl:bl,p0.05)7、组织块培养与消化分散培养皮肤成纤维细胞原代培养一般采用组织块法和酶消化分散细胞法两中方法进行培养。7.1实验方法采用1%新洁尔灭洗涤,采样后皮肤组织用1%新洁尔灭浸泡5min进行消毒处理,PBS洗涤多次,获得的皮肤组织块采用下列方法进行培养,目的在于选择合适的培养方法。7.1.1 组织块培养直接将组织块接种到培养瓶(50ml)底部,每瓶置约15块,均匀铺开,翻瓶,加5mlDMEM(10%NCS)培养液,培养24h,翻瓶,使培养液浸润组织
17、块,继续培养。培养条件为37、饱和湿度、5%CO2,以下相同。7.1.2 0.25%胰蛋白酶消化后组织块培养皮肤组织块先用0.25%胰蛋白酶37消化30min,弃酶液,加DMEM(10%NCS)培养液终止消化,稍吹打,进行组织块培养,方法同上。7.1.3 0.25%胰蛋白酶消化分散细胞培养皮肤组织块用0.25%胰蛋白酶在37下消化30min,弃酶液,加入培养液终止消化,反复吹打,100目纱网过滤,1000rmin一1,离心5min,计数,调整细胞浓度106cellsmin-1,每瓶接种2ml,添加培养液至5ml,培养48h后,换液,继续培养。表3组别Grope培养方法Culture metho
18、d细胞出现时间（天）Time of cell appear传代培养(第 天)Time of subculture细胞生长情况Growth of cell1组织块法7-1015-20上皮细胞先生长成纤维细胞后生长20.25%胰酶消化组织块法2-510-15细胞顺序同上细胞生长快30.25%胰酶消化分散组织块法2-314-20贴壁细胞少杂质多、生长慢消化培养法常采用胰蛋白酶进行消化,因酶的消化作用受pH值、温度、组织的硬度以及酶浓度的影响。因此,消化时间和消化液浓度较难掌握,时间过长或浓度过高都会使细胞受损,时间过短或浓度过低则达不到分散的目的,培养效果极不稳定。而且分散细胞在体外培养时经历的生长
19、环境变化大,难以存活和生长。此外,消化法培养过程中要进行过滤、离心等过程,易增加污染机会。本试验中也发现,采用0.25%胰蛋白酶消化皮肤组织虽然获得了大量细胞,但接种后贴壁生长的细胞较少,培养效果不好,可能与胰蛋白酶的生物学特性有关。胰蛋白酶是从动物体中提取的一种水解酶,主要用于消化细胞间质。与胶原酶相比,胰蛋白酶对细胞的损害较大,常与鳌合剂乙二胺四乙酸钠(EDTA一Na)、柠檬酸钠、构梅酸钠等联合使用,或进行冷消化来降低对细胞的损害,提高消化效果。若组织较硬、胶原成份较多时,胰蛋白酶解离细胞的效果较差,可用胶原酶来代替。贴壁依赖性细胞的细胞膜表面附着一些由细胞分泌物形成的粘蛋白膜,使细胞粘附
20、于支持物的表面,有利于细胞贴壁生长。当胰蛋白酶将细胞分泌的粘蛋白膜水解后若还没有终止,则胰蛋白酶就有可能进攻细胞内的某些蛋白质,造成它们的解离,从而诱发细胞调亡。用于细胞核移植供体的对象多为育种价值高或珍贵稀有的动物,为了减少采样造成的应激、降低对其健康状况和应用价值的影响,所取的组织块都很小,所以为了提高培养成功率,一般采用组织块法进行原代培养。组织块培养法获得细胞比较整齐,成纤维细胞与上皮样细胞分块生长,且这两种细胞对酶的敏感程度不同,所需的消化时间不同,因此便于分离和收集细胞,培养动物的成纤维细胞多采用这种方法。但组织块法培养存在原代细胞生长慢、获得传代细胞时间长的缺点。为缩短组织块法培
21、养获得传代细胞的时间,提高培养效果,本试验对组织块进行酶消化处理后进行组织块法培养,结果表明细胞开始游离生长和获得传代细胞的时间比不经酶处理提前3一5天。酶消化处理后,组织块内细胞之间相互分离,但又没有完全脱离,在一定程度上保持了在体内时的相互作用,所以细胞容易游离并生长。该培养方法即缩短了获得传代细胞的时间,提高了培养成功率。参考文献：1胡葵葵,胡琼华, 戴育成. 皮肤干细胞的研究进展J. 国外医学.皮肤性病学分册, 2004(02)2韩忠朝.血液干细胞研究进展 J. 基础医学与临床,2002(04)3谢晓繁,贾赤宇,付小兵,刘虎仙.表皮干细胞分离和鉴定的研究进展J. 感染.炎症.修复,Infection.Inflammation.Repair,2005（01）