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1、抗犬细小病毒的单克隆抗体的制备王彦红 , 杨跃飞 , 殷俊 , 杨玲 , 徐向明 , 李厚达( 扬州大学畜牧兽医学院动物医学系 , 江苏 扬州 225009)摘 要 : CPV2YZ 株的细胞培养液经蔗糖密度梯度离心纯化后作为免疫原免疫 BALB/ C 小鼠 ,应用杂交瘤技术筛选出 8株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞 ,分别命名为 F5 G10 、3F11F4 、F11 G6 、6C5C2 、6 E4 G3 、6C2B11 、F11D6 、3D9C4 株 ,各株 单抗均为 IgG 型 ;中和试验表明 : F11 G6 、3D9C4 、6 E4 G3 、6C5B11 4 株单抗有中和作用 ,
2、Dot2EL ISA 试验证明了 8 株单抗仅针对病毒抗原决定簇的空间结构 。关键 : 犬细小病毒 ; 杂交瘤细胞 ; Dot2EL ISA中图分类号 : S 852. 65 + 9. 2文献标识码 : APREPARATIO N OF MO NOCLO NAL ANTIBOD IES A GAINSTCANINE PARIVIRUSWANG Yan2hong , YANG Yue2fei , Y IN Jun , YANG L in , XU Xiang2ming , L I Hou2da( Dept of Vet Med , Ani Sci and Vet Med Coll , Yangz
3、hou Univ , Yangzhou 225009 , China)ABSTRACT : Eight hybridoma cell lines secreting monoclonal antibody (McAb) against CPV have been established. They were respec2 tively named F5 G10 , 3F11F4 , F11 G6 , 6C5C2 , 6 E4 G3 , 6C2B11 , F11D6 , 3D9C4. McAbs subclass is IgG. All were analyzed by Do2t EL ISA
4、. McAb only binds to viruses that have three2dimension structure .KEY WO RDS : canine parvovirus ; hybridoma cell ; Dot2EL ISA自 1975 年 Kohler 和 Milstein1 建立了淋巴细胞杂交瘤技术 ,单克隆抗体技术广泛应用于生物医学科学的许多领域 。笔者应用杂交瘤技术获得了 8 株稳定分泌 CPV2YZ 株单抗的杂交瘤细胞株 ,对 8 株单抗 的生物学特性作了进一步研究 。1 材料与方法1. 1病毒提纯CPV2YZ 株的细胞培养液经 37 和 - 20 反复冻
5、融 3 次 , 4 000 r/ min 离心 30 min , 取上清 , 10 000 r/ min 离心 30 min , 取上清 。加入 8 % PEG6000 、3 % NaCl 混匀2 , 4 过夜沉淀 , 10 000 r/ min 离心 60 min , 取沉淀用少量的 PBS 悬浮 ,再经 20 %65 %的蔗糖梯度离心 ,取条带 ,用 HA 检测 ,将有血凝价的条带经透析 ,少量分装 , - 20 保存备用 。1. 2单克隆抗体的制备按参考文献 3 的方法进行 ,提纯的 CPV2YZ 株抗原免疫 8 周龄 BALB/ c 雌性小鼠 , 取免疫鼠的脾细 胞与骨髓瘤 细 胞 融
6、 合 后 , 筛 选 方 法 采 用 间 接 EL ISA 。采 用 方 阵 滴 定 法4 确 定 抗 原 最 佳 包 被 浓 度 为收稿日期 : 2001 05 20基金项目 : 江苏省科委 Beagle 犬基地建设基金项目作者简介 : 王彦红 (1974 - ) , 女 , 安徽寿县人 , 扬州大学硕士 , 主要从事临床兽医工作 。E ma il : wyhyys 163. com16g/ mL , 用 p H 9 . 6 的 0 . 05 mol/ L 碳酸盐缓冲液稀释提纯的抗原包被酶标板 ,设置阳性对照 (免疫鼠血清) 、阴性对照 (正常鼠血清) 和空白对照 ,酶联免疫检测仪测定 OD
7、490 , P/ N 2 . 1 并接近阳性对照的杂交 瘤细胞为阳性 。检测为阳性的杂交瘤细胞按有限稀释法进行亚克隆 3 次 ,挑选反应较强的单克隆细胞扩大培养作为建株细胞 ,制备腹水 。1. 3单抗特性的鉴定按照单抗亚类鉴定试剂盒方法进行 , 以出现阳性孔的羊抗鼠血清类型作为单抗 的 亚 类 。用 HI 、EL ISA 和 IFA 法检测腹水效价 。1. 4中和试验采用固定血清2稀释病毒法5 。制备的腹水 1100 稀释后 ,将 CPV2YZ 株病毒液作连续的 10 倍稀 释 ,与等量的腹水 37 培养 1 h , 加入未形成单层的细胞中 ,设置病毒对照 ,空白对照 , 6 d 后观察结果
8、,并计算中和指数 。1 . 5 .Dot2EL ISA将 CPV2YZ 病毒液分为 3 组 : 第 1 组未处理 ; 第 2 组加入 6 加样缓冲液 0 . 3 mol/ L , p H 6 . 8 , Tris2HCl , 12 % ( W/ V ) SDS , 0 . 6 % ( W/ V ) 溴酚蓝 , 60 % ( V / V ) 甘油 , 0 . 6 mol/ L DTT 混合 , 100 煮沸 3min ; 第 3 组经 100 煮沸 3 min 。3 组样品分别在硝酸纤维素膜光滑面上点样 ,并作好标记 。自然晾干 后将膜置于封闭液中 , 37 2 h , PBST 洗涤 5 次后
9、置于单抗溶液 (140 稀释) ,设置阳性对照 ( 免疫鼠血 清) ,阴性对照 (正常鼠血清) , 37 作用 60 min , PBST 洗涤 5 次 ,置于工作浓度的 HRP 标记羊抗鼠 IgG 溶液 (美国 Sigma 公司产品) , 37 作用 60 min , PBST 洗涤 5 次 ,最后用 0 . 5 mg/ mL DAB 避光显色 ,水洗 终止反应 。2 结果与分析2. 1单克隆抗体的制备本试验经过细胞融合 、间接 EL ISA 筛选 ,共获得 8 株能稳定分泌单克隆抗体的阳性克隆 ,分别命名 为 F5 G10 、3F11F4 、F11 G6 、6C5C2 、6 E4 G3 、
10、6C2B11 、F11D6 、3D9C4 。2. 2单克隆抗体的主要生物学特性筛选出的单抗属于 IgG 亚类 , EL ISA 效价在 11 280 以上 , HI 在 11 280 以上 , IFA 在 1100 以上 ,只 有 F11 G6 、3D9C4 、6 E4 G3 、6C5B11 4 株单抗有中和作用 (表 1) 。表 1 抗犬细小病毒单抗的生物学特性Table 1Biologic of monoclonal antibody单抗腹水效价 Titres of Mabs单 抗Monoclonal单抗亚类SubtypeHIEL ISAIFANTF5 G103F11F46 E4 G3F1
11、1 G66C2B116C5C2F11D63D9C4IgG1IgG3IgG1IgG2bIgG1IgG1IgG1IgG2b12 56012 56011 28011 28011 28011 28011 28011 28011 28012 56011 28011 28012 56011 28012 56012 5601100110011 00011 00011 000110011 00011 00012012011001100110012012011002 . 3Dot2EL ISADot2EL ISA 试验结果如图 1 所示 ,阴性血清与 3 种样品均无反应 ;阳性血清和 8 株单抗经 6 加样缓
12、冲液变性处理后都与 CPV2YZ 株无反应 ,与未经任何处理的病毒反应较强 ,与煮沸后病毒反应相对较图 1 Dot2EL ISA 反应结果Figure 1 Results of Dot2EL ISA膜的第 1 行点样为未经处理的病毒液 ;第 2 行点样为经 6 加样缓冲液 ,经 100 煮沸 3 min 处理的病毒液 ; 第 3 行 点样为经 100 煮沸 3 min 处理的病毒液 。1 . F11D6 ; 2 . 6C2B11 ; 3 . 阴性血清 ; 4 . F5 G10 ; 5 . 6C5C2 ; 6 . 3D9C4 ; 7 .6 E4 G3 ; 8 . 阳性血清 ; 9 . 3F11F
13、4 ; 10 . F11 G4 The first line CPV was untreated , the secondswas treated by heating 3 min2utes with 6 buffer , the thirdswas treated by heating antibody. 1 . F11D6 ; 2 . 6C2B11 ; 3 . positive ; 4 . F5 G10 ; 5 . 6C5C2 ; 6 .3D9C4 ; 7 . 6 E4 G3 ; 8 . negative ; 9 . 3F11F4 ; 10 . F11 G43讨论Dot2EL ISA 试验
14、结果表明 : 3F11F4 、F11 G6 、6C5C2 和 3D9C4 4 株单抗只能与未灭活的具有空间结构的病毒粒子结合 ,推测这 4 株单抗可能与病毒粒子衣壳蛋白暴露在外部的抗原决定簇结合 ; F5 G10 、6 E4 G3 、6C2B11 和 F11D6 4 株单抗既能与未处理的病毒给合 ,也能与煮沸的病毒结合 ,煮沸后破坏了次 级键 ,破坏了部分空间结构 ,但没有改变结合位点 ,因而表现出不同程度的结合 ;加入 6 加样缓冲液变性后 ,病毒粒子衣壳蛋白裂解成 2 种蛋白即 VP1 和 VP2 , 阳性血清和 8 株单抗都不出现反应 ,可能是变 性的 、仅有一级结构的蛋白失去原有的空间
15、结构和抗原决定簇 ,单抗无法识别 ,因此 ,无法用 Western2 blotting 验证单抗是针对 VP1 还是针对 VP2 位点 。反过来推测由于犬细小病毒只有一种血清型 ,衣壳蛋 白由 VP1 和 VP2 2 种蛋白组成 , VP2 是主要衣壳蛋白 ,犬细小病毒的抗原性和血凝性是由 VP2 结构蛋白决定的 ,而且犬细小病毒的 VP2 似乎包含所有中和位点6 , 因此从中和保护试验推测 F11 G6 、3D9C4 、6 E4 G3 、6C5B11 可能是针对 VP2 。筛选出的 8 株单抗仅与有空间结构的病毒粒子结合 ,可能是由于免疫小鼠时用的病毒未作灭活处 理 ,病毒完整颗粒免疫小鼠
16、,暴露在衣壳蛋白外的抗原决定簇免疫应答起主要作用 ,内部抗原决定簇产生的应答反应较弱 ,有反应单克隆杂交瘤细胞在筛选中丢失或未筛选到 。犬细小病毒的免疫原性较差 ,在单抗筛选中常出现单克隆杂交瘤细胞丢失现象 ,有 4 株单抗在第 2 次亚克隆前丢失其分泌单抗的能 力 。参考文献 :1Kohler G , Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity J . Nature , 1975 , 256 : 495- 497.陈爱素 , 沙 音 , 卢炳魁 . 犬细
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