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1、外周血循环DNA 作为生物标志物在卵巢癌临床中的应用研究试验方案试验目的：外周血循环游离DNA乍为生物标志物在卵巢癌临床应用的价值试验类别：诊断试验申办单位：苏州大学研究单位：苏州大学附属第二医院试验负责人：李凯主要研究者：张荣试验日期： 2012 年 11 至 2017 年 11 月联系人：张荣0512-67784769一、临床试验背景卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，卵巢癌的死亡率居妇科肿瘤首位。70%的患者发现时已是晚期（出期和IV期），虽经积极治疗，5年生存率也仅为15%20%,若早期（I期）发 现，5年生存率可达77%87%,若为分化良好的I期患者，5年生存率可达到94%1。因此，提高
2、生存率的关键是早期诊断。特异而敏感的肿瘤标记物在辅助诊断卵巢癌中起重要作用。近年来检测肿瘤患者外周血中游离DNA的改变为肿瘤的早期诊断和复发监控提供了一种新的手段。游离 DNA可存在于血浆或血清、脑脊液及滑膜液等体液中，是指一种游离 于细胞之外的DNA ,其中血液中的相应成分又称循环游离DNA或循环DNA。早在1947年Mandel等2就发现了人的血液循环中存在游离DNA。自1977年leon等3发现肿瘤患者的血浆DNA含量明显高于正常人后，关于肿瘤患者血中游离 DNA的研究逐渐成为人们关注的热 点。对游离DNA的定性研究显示，肿瘤患者的血浆DNA具有与肿瘤细胞DNA 一致的基因异 常4-7。
3、通过研究发现，原癌基因的突变，抑癌基因甲基化改变和微卫星不稳定性改变8-9,可以预测肿瘤患者的预后10。目前国外对血中游离 DNA的研究多集中在肺癌、直肠癌、乳腺 癌、前列腺癌、黑色素瘤等西方国家的“多发病”上，对卵巢癌的研究不多。Hagiwara等11 对肺癌吸烟与不吸烟患者及健康人的游离DNA分别进行了 p53基因编码子248和249的突变检测，认为吸烟者游离 DNA中p53基因突变可作为癌症的预测指标。Ryan等12对大量结肠癌患者白勺游离DNA研究表明，游离DNA中k-ras基因突变的患者肿瘤复发率可达62. 5%。欧洲癌症和营养学前瞻性队列研究收集了准健康者至其癌症发生后的游离DNA
4、 ,进行了 k-ras基因12位编码子和p53基因的突变检测，这一系列研究包括膀胱癌、肺癌、上消化道癌等， 研究发现在肿瘤得到临床诊断前18. 3个月，在血中游离DNA中就可检测到相应的基因突变,这种可预测性与肿瘤原发部位、类型和分期相关。Frattini等13表明，游离DNA定量、定性及定点的联合检测将提高肿瘤的临床诊断率。 该研究观察了大肠癌患者手术前后的游离DNA水平和游离DNA中k-ras和p16的变化，发现术后游离DNA水平逐渐下降，当肿瘤复发时快速升高，并重新可以检测到突变的 k-ras和p16基因的甲基化。Melnikov14等用甲基化特异性PCR检测了卵巢癌患者手术的肿瘤组织和
5、血 浆中的甲基化差异，发现将 BRCA1、HIC1、PAX5、PGR、THBS1基因合并检测，诊断卵巢 癌的敏感性为85%,特异性为61%,其效率与直接应用肿瘤组织相当。Dobrzycka15等用PCR-RFLP的方法评价了血浆游离 DNA与卵巢癌进展的关系，发现游离DNA的增加与肿瘤生存率降低有关。根据以上研究结果，我们希望可以通过类似的研究，发现卵巢癌患者游离DNA 水平和相关基因的改变，获取相关中国人群血中游离DNA 与卵巢癌病理变化的关系，为卵巢癌防治提供参考，并通过量化相关指标，提供可供复发监控的基因诊断方法。目前研究充分表明了游离DNA 的变化与卵巢癌的关系密切。 游离 DNA 的
6、发现及研究为疾病的非创伤性诊断、 监测提供了可能， 解决了肿瘤基因检测只能用肿瘤组织的标本限制，为肿瘤的诊断、治疗监控、预后随访等研究提供了简便途径。但是，由于游离DNA 的微量存在，使得目前DNA 的提取比较困难，提取试剂昂贵。游离DNA 的检测方法不一，各自敏感度差异较大，游离DNA 检测的特异性低。因此，为方便游离DNA 的临床使用，需要建立实用性较强的检测方法。本试验拟利用高保真DN咪合酶的作用下巢式PCR和甲基化特异性的荧光定量PCR检测游离血中游离 DN蹴度，比较卵巢癌患者、卵巢良性囊肿患者、健康女性中血浆游离DNA浓度的差别，并检测血中和卵巢癌手术标本中热点基因甲基化状态，以期发
7、现外周血DNA的与卵巢癌组织的相关性。 展望未来， 卵巢癌游离DNA 的基础及临床研究必将成为受人瞩目的研究热点。二、试验目的评价血浆游离DNA 作为生物标志物在卵巢癌诊断及预后方面的意义。三、试验设计本试验为回顾性队列研究。四、受试者的选择和退出1. 入组标准：年龄： 20-80 岁。性别：女。1）卵巢癌组：具有病理学诊断依据的新发卵巢癌病例。签署知情同意书。2）良性卵巢囊肿组：手术病理确诊的良性卵巢囊肿的病例。签署知情同意书。2 .排除标准：1）合并其他恶性肿瘤患者。2）妊娠。3）合并自身免疫性疾病。3 .受试者中途撤出标准。1）研究者从医学角度考虑受试者有必要中止试验。2）患者自己要求停
8、止试验。五、病例数及分组方法分为卵巢癌组、良性卵巢囊肿组及健康对照组。运用队列研究，卵巢癌组样本量 50例，良性卵巢囊肿组50例，健康对照组50例。六、临床试验步骤：（一）收集标本1 .卵巢癌组1）患者术前采集肘静脉血 6ml,用EDTA抗凝。2 ） 术中取新鲜卵巢癌组织标本1*1*1cm3,置-80C冰箱中保存。3）卵巢癌患者于术后1周采血查血游离 DNA浓度及完整性。之后按卵巢癌的随访标准，术后第一年每个月随访一次，术后第二年每三月随访一次，术后第3年每半年随访一次，术后第4、5年每年随访一次。每次随访时查血游离DNA浓度及完整性、血常规、生化常规，血CA-125,视临床情况行影像学或妇科
9、彩超检查。共随访 5年。3 .良性卵巢囊肿组：1）患者术前采集肘静脉血 6ml,用EDTA抗凝。2）术中取新鲜卵巢良性囊肿组织标本1*1*1cm置-80C冰箱中保存。3）良性卵巢囊肿的病人于术后一月和术后半年各随访一次，以后每年随访一次，共随访5年。每次随访时测血浆游离DNA浓度及完整性、血 CA-125 ,视临床情况行影像学或妇科彩超检查。4 . 健康对照组：采集肘静脉血6ml ，用 EDTA 抗凝，测血浆游离DNA 浓度及完整性。每年随访一次，共随访 5 年。（二）血浆游离DNA 浓度及完整性的检测1. 标本采集后 2 h 内送实验室。2. 常温下 3000r/min 离心 10 min
10、，小心吸取上清血浆转移至3 ml 离心管中， 3000r/min 离心 10 min ，吸取上清，置-80冰箱中保存。3. 解冻血浆，血浆DNA 抽提采用 QIA amp Blood Mini Kit（Qiagen 公司 ），按说明书进行。4. 游离 DNA 浓度及完整性测定： 根据文献中给出的 ALU 基因的序列设计两对引物， 一对引物为文献中已经给出的引物， 扩增115bp长度，另一对引物自己设计， 扩增长度为219bp, 均由由上海生工合成。 115bp:ALU 115-1 ： CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG ， ALU 115-2 ： CCCGAGTAGCTGGGATTACA
11、 。219bp: ALU 219-1 : CACGCCTGTAATCCCAGCACTTT , ALU 219-2 ： ATCTCGGCTCACTGCAACCTCC 。以提取的血浆DNA 为模板，进行PCR扩增。 以试剂盒内已知的标准品浓度可计算出实验标本的游离DNA 浓度。 计算血浆游离DNA 完整性：血浆游离 DNA 完整性=ALU219-qPCR/ （ALU115-qPCR+ ALU219-qPCR ）。5. 检测血中和卵巢癌手术标本中热点基因甲基化状态：利用高保真DNA 聚合酶的作用下巢式 PCR 的方法，根据肿瘤相关基因（根据相关文献和NCBI 中的序列信息）设计引物，做巢式PCR （
12、高保真酶），将得到的PCR产物测序。根据测序结果再设计引物，进行甲基化特异性荧光定量PCR,提取健康人的、卵巢良性囊肿患者、卵巢癌患者手术前后的血浆游离DNA做模板，两端设计引物做荧光定量 PCR,看不同组之间的游离 DNA甲基化的数 量是否有显著性差异。6. 随访观察：三组实验对象于随访期内定期抽血检测血浆游离DNA 浓度及完整性。（三）观察指标各组血浆游离DNA 浓度及完整性、卵巢癌相关基因甲基化状态。七、统计分析本试验统计分析选用符合方案数据集， 即所有符合试验方案要求的受试者数据进行统计 分析。采用 Dunnett s 多组对比、 t 检验、 Spearman s 相关性（一致性）检验
13、、ROCffl线分析和多分类logistic回归双侧检验。八、试验段质量控制和保证本研究过程中， 将由申请者指派的临床监查员定期对研究医院进行现场监查访问， 以保证研究方案的所有内容都得到严格遵守和填写研究资料的正确。 参加研究人员必须经过统一培训， 统一记录方式与判断标准。 整个临床试验过程均应在严格操作下进行。 研究者应按病例报告表填写要求，如实、详细、认真记录 CRF 中各项内容，以确保病例报告表内容完整真实、 可靠。临床试验中所有观察结果和发现都应加以核实， 以保证数据的可靠性，确保临床试验中各项结论来源于原始数据。在临床试验和数据处理阶段均有相应的数据管理措施。九、伦理学要求本临床试
14、验必须遵循赫尔辛基宣言和中国有关临床试验研究规范、 法规进行。 在试验开始之前，须经苏州大学附属第二医院伦理委员会批准认定该试验方案后方可实施。 每一位患者入选本研究前， 研究医师有责任以书面文字形式， 向其或其指定代表完整、 全面地介绍本研究的目的、 程序和可能的风险。 应让患者知道他们有权随时退出本研究。 入选前必须给每位患者一份书面患者知情同意书（以附录形式包括于方案中） 。研究医师有责任在每位患者进入研究之前获得知情同意书，并以研究档案保留其中。资料保存： 使用后销毁参考文献：1 Vergot e I, De Brabant e J, Fyles A, et al. Prognosti
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