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1、牛奶中部分成分的分析一、实验目的(1)学习利用等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白(2)掌握双缩月尿法测定蛋白质的原理和方法(3)熟悉可见光分光光度计的操作(4)加强对沉淀、抽滤、溶液配制等基本操作的锻炼(5)分析牛奶中蛋白质与钙的含量。(6)掌握配位滴定法测定液体食品中钙含量的原理和方法(7)通过与牛奶包装上注明的含量比较，对实验分析结果进行客观评价二、实验原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量名为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，加入醋酸将牛乳的pH调至4.7时，使酪蛋白沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质，抽滤、纯化后便可得到纯酪蛋白
2、。双缩月尿(NH2CONHCONH 2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩月尿反应，蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。双 缩月尿法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。钙与身体健康息息相关， 钙除成骨以支撑身体外， 还参与人体的代谢活动，它是细胞的主要阳离子，还是人体最活跃的元素之一，缺钙可导致儿童佝偻病，
3、青少年发育迟缓，孕妇 高血压，老年人的骨质疏松症。缺钙还可引起神经病，糖尿病，外伤流血不止等多种过敏性 疾病。补钙越来越被人们所重视。 牛奶中含有易被人体吸收得钙，有些牛奶产品中还特地加钙而成为钙奶。对于液体牛奶中钙白含量，可采用 EDTA法进行直接测定。考虑到牛奶中含有Fe3+、Al3+等干扰离子，可以加入少量三乙醇胺以消除它们的，调节pH-1213,以铭蓝黑R作指 示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用 EDTA滴定至计量点时，游离出指示剂，溶液 呈现蓝色。三、材料、试剂与仪器（一）材料新鲜牛奶、加钙牛奶（二）试剂95%乙醇、无水乙醛、醋酸、醋酸钠、NaOH、CuS04 5H2O、酒石酸钾
4、、碘化钾、牛血清蛋白（BSA）、EDTA、基准物质CaCO3、HCl、三乙醇胺、铭蓝黑 R、盐酸羟胺、邻二氮 菲（邻菲啰咻）、浓硝酸、硫代硫酸钠、甲基红、氨水1.、0.2 mol L-1 pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液先配A液与B液。A液：0.2mol/L醋酸钠溶液。B液：0.2mol/L醋酸溶液。取醋酸钠固体 1.64g加水溶解并稀释至100ml,取冰醋酸 1.37mL加水稀释至120ml,取A液94.79mL, B液105.21mL,混合即得pH4.7的醋酸一一醋酸钠缓冲液 200mL。2、乙醇一乙醛混合液：乙醇：乙醛=1:1 （V/V）3、NaOH （6mol L-1）：称取12g氢氧化钠
5、溶于50mL水中。4、双缩月尿试剂：称取 CuS04 5H2O 3.0g,酒石酸钾9.0 g和碘化钾5.0g,分别溶解后混匀，力口 6 mol L-1NaOH l00mL ,最后加水至1000mL,贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。5、0.9%NaCl6、蛋白质标准液（10mgmL-1）,用小烧杯称取干燥的牛血清蛋白100.0mg ,以少量生理盐水溶解后倒入10mL容量瓶中，淋洗小烧杯数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至 刻度线。7、待测蛋白样本：将牛奶样品用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定；将制得的酪蛋白用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定。（如若不能溶解，滴加几滴6mol/
6、L NaOH溶液、分别用10mL容量瓶定容）8、EDTA（0.01mol L-1）:称取2.0g EDTA二钠盐，用温热水溶解后，稀释至 500mL,储存于 聚乙烯塑料瓶中。9、CaCO3标准溶液(0.01 mol L-1)：准确称取基准物质 CaCO30.1g左右，先以少量水润湿,以水稀再逐滴小心加入 6 mol L-1HC1 ,至CaCO3完全溶解，定量车专人100mL容量瓶中,释至刻度,算其浓度。10、NaOH (5 mol L-1)11、HCl (6 mol L-1)12、三乙醇胺(200g L-1).13、铭蓝黑R(5 g L一1)乙醇溶液(三)仪器锥形瓶、试管、移液管(1mL、5m
7、L、20 mL)、 l0mL容量瓶、烧杯、表面皿、250mL60mL分液漏斗1000mL棕色试剂瓶、25mL具塞比色管、试管架、塔竭、水浴箱、可见光分光光度计、离心机、抽滤装置、精密pH试纸(可测pH4.7),酸度计、电炉、温度计 四、操作步骤(一)牛奶中酪蛋白的提取1、酪蛋白的粗提40C、pH4.7的醋酸缓冲液 50mL50mL鲜牛奶加热至 40 Co在搅拌下慢慢加入预热至用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟( 3000 r min-1)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。2、酪蛋白的纯化用水洗涤沉淀 3次，离心10分钟(3000rmin-1),弃去上清液。在沉
8、淀中加入 30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇一乙醛混合液洗沉淀 2次。最后用乙醛洗沉淀 2次，抽干。将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。3、准确称重，计算含量和得率含量：酪蛋白g/(100 mL)牛乳得率提取得到的含量真实含量100%（二）酪蛋白含量的测定1、标准曲线的绘制与样品的测定取试管8支，按下表操作。123456测定管1测定管2蛋白质标准液（mL）一0.200.400.600.801.00一一待测蛋白样品（mL）一一一一一一1.001.000.9%NaCl(mL)1.000.80.600.400.20-一一双缩月尿试剂（mL）4.004.004.00
9、4.004.004.004.004.00吸光度A各管混匀、放置 37c水浴中保温20min。540nm比色，以空白管调零点，读取各管吸光度值。2、计算在电脑上以吸光度值为纵坐标， 以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 从标准曲线中查 出待测样本的蛋白质浓度 （g/L）,并求出牛奶中蛋白质浓度。由此浓度计算出100mL鲜牛奶中酪蛋白的真实含量。（三）钙含量的测定1、EDTA溶液浓度的标定准确移取20.00mL CaCO 3标准溶液3份分另于250mL锥形瓶中，力口入2mL NaOH溶液， 铭蓝黑R指示剂34滴，用EDTA溶液滴定至溶液由红色变为蓝色即为终点，根据滴定用 去EDTA毫升数和CaCO3
10、标准溶液的浓度，计算 EDTA溶液的浓度。2、钙制剂钙含量的测定准确移取一定量的鲜牛奶和钙奶，分别转移到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。准确移取上述试液 20.00mL,加入三乙醇胺溶液 5mL, 5mol L-1NaOH 4mL ,加入水 20mL ,摇匀，加铭蓝黑R34滴，用0.01mol L；1EDTA标准溶液滴定，接近终点时再补加 2 3滴铭蓝黑R,当溶液由红色变为蓝色即为终点，根据消耗EDTA的体积，计算出鲜奶和钙奶中钙的含量（g/100 mL）,并与包装上注明的含量作比较。3、注意事项23滴指示剂。量取鲜奶和钙奶的量视钙含量多少而确定，以消耗0.01 mol L-1EDTA体积为2030 mL。牛奶、由于钙奶均为乳白色，终点颜色变化不太明显，接近终点时再补加思考题1、了解蛋白质及钙、铁、锌等微量元素与人体健康的关系3、本实验中哪些物质质量需要准确称量，哪些溶液体积需要准确量取？4、除本实验选用的方法外，测定蛋白质与钙还有那些方法？.