热力灭菌工艺的微生物学验证.doc

《热力灭菌工艺的微生物学验证.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《热力灭菌工艺的微生物学验证.doc（30页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、热力灭菌工艺的微生物学验证注射剂无菌保证工艺研究及评价的原则要求注射剂无菌保证工艺是指为实现规定的无菌保证水平所采取的经过充分验证后的灭菌（无菌）生产工艺。目前，注射剂的无菌保证工艺主要有两种：1.终端灭菌工艺：在控制微生物污染量的基础上，在药品灌封后，通过湿热灭菌方式除菌。一般来说，本方法成本低，无菌保证水平高，适宜于大容量注射剂和小容量注射剂的灭菌。2.无菌生产工艺：在无菌系统环境下，通过除菌过滤法或无菌操作法，以防止污染为目的，消除导致污染的各种可能性来保证无菌水平。一般来说，由于本方法对环境系统的要求高，且影响无菌操作的因素多而使得无菌保证水平比终端灭菌工艺低。无菌生产工艺一般适宜于粉

2、针剂，亦可适宜于临床需要但不能进行终端灭菌的小容量注射剂。由此，终端灭菌工艺和无菌生产工艺具有不同的系统要求、不同的除菌方法和不同的无菌保证结果。评价无菌保证工艺是否有效曾一度主要通过对终产品抽样进行无菌检验来判断；由于微生物在产品中的分布是不均匀的，且抽检样品的数量有限，故抽检的结果不能真实代表整批产品的无菌状态。国际上更为注重无菌保证工艺的设计是否合理、所用的设备与工艺是否经过充分的验证，在此基础上，切实按照验证后的工艺进行生产，这样才能保证灭菌（无菌）工艺的可靠性。在业界，常用“无菌保证水平”（Sterility Assurance Level,SAL）概念来评价灭菌（无菌）工艺的效果，

3、SAL的定义为产品经灭菌/除菌后微生物残存的概率。该值越小，表明产品中微生物存在的概率越小。为了保证注射剂的无菌安全性，国际上一致规定，采用湿热灭菌法的SAL不得大于10-6，即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一；而采用无菌生产工艺的产品，其SAL一般只能达到10-3，故仅限于临床必需注射给药而确实无法耐受终端灭菌的产品。无菌生产工艺只适用于粉针剂或部分小容量注射剂。一、注射剂剂型选择的原则从无菌保证水平的角度考虑，注射剂剂型选择的一般原则如下：1首先要考虑被选剂型可采用的灭菌工艺的无菌保证水平的高低。原则上首选剂型应能采用终端灭菌工艺（F08），以保证SAL10-6。2对于有充分的依据

4、证明不适宜采用终端灭菌工艺（F08）且临床必需注射给药的品种，可考虑选择采用无菌生产工艺的剂型。通常无菌生产工艺仅限于粉针剂或部分小容量注射剂。二、无菌保证工艺的技术要求1大容量注射剂（1） 应采取终端灭菌工艺，建议首选过度杀灭法（F012），如产品不能耐受过度杀灭的条件，可考虑采用残存概率法(8F0酵母菌及霉菌革兰阳性细菌革兰阴性细菌病毒。具备核膜结构的真核微生物，在60一80下就可被迅速杀灭。绝大多数细菌的营养细胞在45以上就不能生长，80一100下就可被迅速杀灭，但是，某些嗜热细菌甚至可在80以上的高温中生存。多数病毒是热敏性的。需氧菌中的芽胞杆菌属(Bacillus)和厌氧菌中的梭状芽

5、胞杆菌属(Clostridium )，也具有较强的耐热性。这些细菌的细胞能产生内源性芽胞或胞间休眠休，它们一旦成熟，便会对热、干燥及有害化学物质等有较强的抗性。要想使这些芽胞在一分钟内死亡90%，则必须使干热温度在100-170之间或湿热温度在80-129之间才能达到这一目的。在这样的温度范围内，对芽胞的杀灭效果要相差约104或105倍。 细菌芽胞的耐热性与很多因素相关，芽胞形成时，细菌停止生化反应，并将遗传物质包于芽胞内。随之进行一系列生物物理变化:细胞质大量脱水并体积减小，然后在缩小的原生质体周围形成一层厚壳。此过程中形成了一种名为吡啶二羧酸或DPA(吡啶一2,6一二羧酸)的特殊化学物质。

6、芽胞形成阶段，吡啶二羧酸钙与DNA以及细胞内的酶形成复合物，以保护处于恶劣环境中的芽胞。芽胞可以在休眠状态下存活多年，一旦条件利于萌发，便可在几分钟内恢复到生长状态。 （二）、影响灭菌效果的因素1.物理/化学条件 在细菌芽胞形成期，环境因子会影响其耐热性。例如，在较高温度下生长，并且有二价阳离子(如Ca 2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+)存在时，可增强芽胞的耐热性，当pH值超出6.0一8.0的范围时，或在芽胞形成环境中存在高浓度的盐水或磷酸盐，均会降低芽胞的耐热性。成熟芽胞的耐热性亦与环境条件相关，如溶液浓度、水活度，pH值或在环境中存在对芽胞造成物理性损伤或抑制其萌发的化学类物质，均会影响

7、芽胞的耐热性。如果芽胞是包裹在晶体或有机物内，其耐热性通常明显高于非包裹性芽胞。2.湿度水在热力杀灭细菌芽胞时起着重要作用。湿热和干热灭菌均与水相关，当湿度达到饱和时相对湿度(RH)为100%，所进行的热灭菌方式称为湿热灭菌；在其他相对湿度下进行的灭菌都称为干热灭菌。现已知道，在90一125之间，当相对湿度在20%一50%时，细菌芽胞表现出最大的耐热性，而当相对湿度超出这一范围时，芽胞的耐热性将会迅速下降。3.微生物的热致死特性通过一条半对数关系直线最能说明微生物的热致死性，直线的斜率随着温度升高而增大。这就是说，在特定温度下，任一时间点的芽胞死亡特性仅与这个时间点的芽胞浓度相关。这种一级致死

8、特性是原核细胞独有的现象。（三）、热力学灭菌工艺原理简介1.湿热灭菌对于适宜采湿热灭菌方式的产品或物品湿热灭菌是一种十分经济有效的方法。通常情况下，湿热灭菌是指采用一定压力下的蒸气进行灭菌，也采用过热水喷淋或浸没。水由液态变成气态时，会吸收大量的热能(540cal/g)，气态冷凝成液态时，会释放相等的能量(即汽化热)。蒸气接触到温度较低的物体就会释放潜热而凝结成水，直到此物体的温度与蒸气温度相等。 现已明确，湿热灭菌的效应是导致细胞内的关键性蛋白质和酶发生热变性或凝固。湿度对该破坏性过程起促进作用，这就是湿热灭菌较干热灭菌需要较低温度的原因。2.干热灭菌干热灭菌是指在非饱和湿度下进行的热力学灭

9、菌。干热灭菌时的相对湿度范围可从99.9%至1%以下。干热灭菌用加热介质就是一定湿度条件下的空气，通过强制对流而运动。由于热空气会带走水分，被灭菌物品包括芽胞)也会逐渐失水，从而使微生物的灭菌率也发生相应的变化。 干热灭菌与湿热灭菌的动力学特征相似，但反应机制却有所不同。干热灭菌是使微生物氧化而不是蛋白质变性，这就是干热灭菌之所以要求相对较高温度的原因。 在制药工业中，干热灭菌被广泛用于不耐受高压蒸气的热稳定性物品的灭菌。常用干热进行灭菌物品有：甘油、油类、凡士林、石蜡以及一些粉状药品，如滑石粉、磺胺类药物以及玻璃容器和不锈钢设备等。3.干热去热原革兰阴性细菌细胞壁中的脂多糖对人有毒性。只有当

10、细胞破裂或溶解时，这种毒素才释放出来，故称之为内毒素。由于低剂量内毒素注入人体后便会导致发热反应，故而也称之为热原。任何旨在去除产品中所含的脂多糖的工艺过程均称为去热原工艺。 干热是去热原最为有效的方法之一。去热原要求的温度很高，如170-250，甚至更高。在170下去热原速度很慢，需约30分钟方能使纯内毒素下降1个对数单位，而在250下达到同样效果则仅需9秒。对干热去热原工艺进行验证时，通常直接向待去热原物品中加人已知最的内毒素。然后证明该工艺能使标准内毒素至少下降3个对数单位。 四、无菌的影响因素 无菌是一个概率函数，它的影响因素可用下式表示: PNSU=N0一DR 其中，PNSU指非无菌

11、品概率；N0指灭菌前产品的污染水平；DR指灭菌时的杀灭水平。 最终产品的无菌质量取决于两个因素:灭菌前的含菌量控制及灭菌工艺的杀灭效果。 五、热力学灭菌的动力学原理根据质量作用定律，在恒定温度及保持其他条件不变的情况下，单位时间内被杀灭的微生物数正比于t0 时原有的数目，即dNdtK(N0Nk)式中，N0为t0时，存活的微生物数；Nk为t时被杀灭的微生物数；N为t时存活的微生物数。将上式积分得到：lgNt lgN0(K2.303)t热灭菌方式下，微生物的死亡是呈几何级数变化的，在半对数图纸上作图，可以得到一条相对比较准确的直线。12 图1.微生存活数与灭菌时间的关系 图2.微生存活数对数与灭菌

12、时间的关系1.D值(对数下降值)D值是指在特定灭菌条件下，使微生物数量下降一个对数单位或减少90所需的时间。它是分析灭菌工艺效果的重要生物学参数。并且其数值可通过残存曲线法或阴性分数法加以确定。lgN0lgNtlgN0Ntt(K2.303)lgl01,所以D=t=2.303K.即，D是直线斜率的负倒数。D 值越大，该温度下微生物的耐热性就越强，在灭菌中就越难杀灭。对某一种微生物而言，在其他条件保持不变的情况下，D 值随灭菌温度的变化而变化。灭菌温度升高时，直线方程的斜率变大，即使微生物杀灭90所需的时间就短。USP 收载的生物指示剂嗜热脂肪杆菌(B.Stearothermophilus)的孢子

13、在121下的D 值在153min 之间。不同温度下，不同的微生物在不同的环境条件下具有各不相同的D值。不同灭菌温度下的D 值表微生物名称温度介 质D值min微生物名称温度介 质D值min嗜热脂肪杆菌105葡萄糖87.8嗜热脂肪杆菌121注射用水3.0嗜热脂肪杆菌110葡萄糖32.0梭状芽孢杆菌105葡萄糖1.3嗜热脂肪杆菌115葡萄糖11.7梭状芽孢杆菌105注射用水13.7嗜热脂肪杆菌121葡萄糖2.4梭状芽孢杆菌105注射用水2.1嗜热脂肪杆菌121葡萄糖乳酸林格液2.12.D 值测定法残存曲线法该法至少需要测试两个样品，分别在设定温度下(如121)暴热不同时间。测定每个热处理样品及未经热

14、处理的对照样品中微生物含量。可采用平皿计数法或经薄膜过滤并置于适当的培养基表面培养。培养终了时，计数每个样品中的残存微生物(Ns), 再将实验数据的平均值取常用对数(lg)，并对相应的曝热时间u(以分钟为单位)作图，可得到存活曲线。在残存曲线上，以一个对数单位的间隔点分别作与x轴和y轴相平行的直线，就可估测出D值；或是用下式计算:Dl21u(1gN0lgNs)。设在D值测定中，曝热5min，lgN0为5，lgNs为2，则Dl215(52)1.7min。D值为存活曲线斜率的负倒数(1K)。因此，D值可在存活曲线的直线段，用最小二次方线性回归分析法求得式中，u为曝热时间(min)：y为曝热条件下存

15、活菌落数的平均值；n 指实验组数。*试验所用仪器应能保持恒温并迅速升温，如生物指示剂耐热性测定仪或毛细管一油浴测定法。阴性分数法(不生长分数法)一种称最可能数测定法(Most probable number method)，仅需一次加热就可估算出 D 值。将一组样品(至少10 个样本)置于设定灭菌温度下，加热到设定时间后，取出并分别作无菌检查。该方法检测灵敏度高于平板计数法。假设条件是微生物存活数从N0 到灭菌终点始终与曝热时间呈线性关系(对数规则)。在温度T下，DT=ulg10N01g2.3031g10(nq) ，式中n样品总数，q曝热处理后的无菌样品数。另一种方法实验时每组至少需要10 个

16、样品，将其置于预定温度下，设置不同的曝热时间，但曝热的时间间隔相同，热处理后，将样品取出，放人无菌液体培养基中，于适宜温度下培养 。培养结束时，记录每组样品中没有微生物生长的样品数。通过阴性分数法估算D值【每组中无微生物生长样品数E（f）/每组样品数（n）】选择全部生长组(0/10)中暴热时间最长者到全部不生长组(10/10)中暴热时间最短者之间的的数据计算D值。从表中可知，本次试验中的两个时间分别是5分钟和15分钟。芽胞完全杀灭(残存芽胞数小于1)时间(T)可用下式计算: T=Tk-d/2-(d/10xf)，其中，Tk指阴性分数范围的下限(全部不生长微生物所需最短时间)，d指暴热时间间隔。

17、由表12一1数据计算，得到: T=15-2/2-(2/10 x 26) = 8.8分钟 然后，按下式计算D值: D=T/（lg10No十0.2507) ，假设N0=105，则D=8.8/ (5+0.2507)=1.7分钟3.Z 值灭菌温度系数 Z 值系指使某一种微生物的D值变化一个对数单位或90%时，所需要的温度变化值，它是制药业灭菌工艺设计及过程监控中的一个常用参数。在湿热灭菌条件下，实验测得细菌芽胞的z值在8-12之间，但计算灭菌率时，z通常取10；而在干热灭菌条件下，Z通常取20。分别测定同一种微生物在不同温度下(其他实验条件相同)的D值，以log10D与对应温度作图，就可以得到一条直线

18、。此直线斜率的负倒数即为温度系数-Z值，它反映了微生物的致死性随温度变化的特性。z值也可用下式计算: Z=（T2-Tl)/log10 (D2/D1)，其中，D1指温度为T1时的D值，D2指温度为T2时的D值。不同的微生物孢子，在不同的溶液中有各不相同的Z 值。同种孢子的Z 值在不同溶液中亦有差异。嗜热脂肪杆菌在不同溶液中的Z 值。溶 液Z值葡萄糖水溶液注射用水葡萄糖乳酸林格氏液pH7 磷酸盐缓冲液平均10.38.411.37.69.4在没有特定要求时，Z 值通常都取10，以简化计算。Z 值被用于定量地描述孢子对灭菌温度变化的敏感程度，Z 值越大，孢子对温度变化的敏感性越弱，此时，企图通过升高灭

19、菌温度的方式来加速杀灭微生物的收效就不明显。灭菌温度Z7Z10Z12Dmim1gDDmim1gDDmim1gD10511011512012l300.00576910.972.081.502.4771.76l1.0330.3180.17660.0018.995.971.891.501. 7781. 2780.7760.2760.17632.6112.404.751.821.501.5131.0930.6760.2600.176Z 值与灭菌温度关系图如果Z10，则110下的D 值为18.99min。Z7时，直线的斜率增大，此时D值升到5767min。当Z=12时，情况正相反，D 值降至12.38m

20、in。当灭菌温度上升时，这3 种微生物孢子相应D 值变化幅度随Z 值的增大而减少的趋势是显而易见的。4. FT 值T()灭菌时间 FT 值指T()灭菌值，系指一个给定Z 值下，灭菌程序在温度T()下的等效灭菌时间。FTDTlgN ,式中，DT 为在T()下微生物的D 值；lgN 为T()下灭菌程序使微生物数下降的对数单位数。当lgN1时FTDT，当药液灭菌前微生物总数为N0时，则在T()将其全部杀灭至100 所需的时间为 FTDTlgN0。因此可以把FT 理解为T()灭菌值，即灭菌程序赋予被灭菌品在T()下的灭菌时间。由于D 值随灭菌温度的变化而变化，所以不同温度下达到相同灭菌效果时，FT 值

21、将随 D 值变化而变化。灭菌温度高时，所需的T()灭菌时间就短；灭菌温度较低时，则所需的T()灭菌时间就长。5. F0 值 标准灭菌时间 系灭菌过程赋予一个产品121下的等效灭菌时间（Z10作为参照标准）。对于干热灭菌而言，标准参照温度为170灭菌值记作FH 。6.灭菌率L指在某一温度T()下灭菌lmin 所获得的标准灭菌时间。L 没有单位。如果已知(实验条件下)某微生物的z值，那么灭菌率: L= Di/D121 =10 (Ti-121)/Z, Ti指各个灭菌时段的温度,标准参照温度（121），常取Z10。F0D l211gN，FTDT1gN，达到同样灭菌效果时，1gN 等值，所以 F0FTD

22、121DT。Z10时不同温度下的灭菌率和121下灭菌1min时所相当的T()灭菌时间灭菌温度灭菌率LF0FT D l21DT122 1201181161141121101.260.7940.5010.3160.1990.1260.079116下灭菌lmin 对芽孢杀灭效果只有标准灭菌状态下的32；110下1 min，仅为标准灭菌状态下的7.9；121下灭菌lmin 相当于110下灭菌12.6min,112下灭菌7.943min；114下灭菌5.012min。7灭菌值(F值)计算实践中，可用灭菌率计算FT值(或灭菌程序的灭菌值)。FT=10 (T0-Tn)/Z dt，也可根据梯形规则，将整个灭菌

23、过程(包括升温、保温和冷却阶段)的灭菌率累加，从而估算出某灭菌程序在标准温度下的等效灭菌时间：FT=t（L1/2+L2+L3+Ln-1+Ln/2）, t指测量温度的时间间隔。每两次测量温度的时间间隔必须相同。在初始及结束时间段的灭菌率非常小，可将公式简化为:FT=tL。由 FT(1gN0lgNT)DT， FTDT 1gN0lgNT，则lgNTlgN0FTDT。根据灭菌设备内温度监控系统所测得的物理参数，可利用该公式来估测某灭菌程序对微生物的杀灭效果。此时，DT表示某实际微生物待灭菌物品中的污染菌)或假设的微生物(生物指示剂)在T下的D值。例如，假设F0为8分钟，耐热芽胞的DT分=0.5分钟，数

24、量为105，由公式可以得出在灭菌结束时，芽胞的残存数量（PUSN)为10-10。lgNT =6-8/0.5=10,在整个灭菌过程中，芽胞数量的对数下降值:SLR=1gN0-lgNT= FTDT =6-(-10) =8/0.5=16。 生物指示剂 一、定义 生物指示剂，简称为BI，是对特定灭菌工艺具有一定耐受性并且能够定量测定灭菌效力的微生物制剂，适用于制备生物指示剂的微生物多为芽胞类细菌，这是因为，除辐射灭菌外，芽胞类细菌比常规的生长态微生物对灭菌工艺具有更强的耐受性。生物指示剂既可用来测定一个给定的灭菌工艺条件的灭菌效果，也可判别它是否符合无菌保证要求。将测温探头置于被灭菌物品内，可获得良多

25、有价值的数据。尽管可用热穿透数据来估测灭菌程序对微生物的致死性，但采用生物指示剂做对照试验，进行完全或部分杀灭，是评判一个灭菌程序有效性的直接方法而且也是最佳方法。 生物指示剂有不同的形式，可将细菌芽胞置于滤纸、玻璃纤维或不锈钢等载体上，或直接接种到产品中。通常，当芽胞接种到液体产品时，其耐热性会有所增强或降低;而有时所用耐热芽胞与产品不相适应。如碰到后一情况，可用生理盐水或其他溶液代替产品进行实验，但必须保证所用的替代品与产品具有相似的物理和化学性质(如粘度和pH)，并且耐热芽胞在替代品中的D值不得小于在产品中的D值。二、组成形式 常用于灭菌工艺验证的生物指示剂主要有三种形式，它们都是用对特

26、定灭菌工艺具有一定耐受性并已知其种类的微生物芽胞制备而成。 (一)芽胞条 将芽胞加在载体上，如接种于滤纸片、玻璃1塑料等薄片或条状物，并用特定的材料包起来以保持其完整性和生物活性，俗称芽胞条。此类指示剂比较适用于验证和监控非溶液类物品的灭菌工艺。 （二)芽胞悬浮液 芽胞悬浮液可被接种于代表性的待灭菌产品溶液或模拟产品溶液中。可用此芽胞悬浮液直接接种于产品内或产品外表面，这样能更加直观地考察产品的实际灭菌效果;如果芽胞悬浮液不宜被直接接种于产品内(或外)，则可用模拟产品替代，但要注意的是，芽胞在模拟产品内(或外)的耐热性不得比在实际产品内的低，否则将影响到灭菌工艺验证或日常监控的可靠性。因此，在

27、使用此类生物指示剂之前，务必侧定芽艳在产品或模拟产品内（或外)的数量，D值、Z值以及存活时间和死亡时间。 (三)自含型生物指示剂 这种指示剂的一种形式是将芽胞条(或片)加人到含有指示剂的培养基包装内(如：小瓶内)，这些培养基事先单独包装井与芽胞载体分离，经灭菌处理后，挤碎培养基小瓶使芽地条(或片浸没在培养基内，在适当温度和时间内培养，通过观察培养基内的酸碱指示剂的颜色变化判断其生长状况;另一种形式是将芽胞直接接种在含有指示剂的培养基内，经培养后生长的微生物使pH值发生变化，引起颜色变化来以指示是否有微生物生长。自含型生物指示剂的耐热性与其载体、包装的材质、结构有很大的相关性；生物指示剂的包装要

28、易于杀菌剂透过、因此，侧定D值时务必要考虑这些因素，尤其是包装可能会引起杀菌效来的滞后.因此，不能仅侧定芽胞条(或片)的D值。 当生物指示剂经受挑战试验后，宜在4小时内培养。从质量保证角度来看，我们应当尽可能地在较短时间内培养经受挑战后的生物指示剂。每个企业应根据自身的条件和特点制定适当的时间限度。 有两种方法可用来判断生物指示剂的芽胞生长状况，一种是通过肉眼观察培养基的颜色变化酸碱指示剂)或浊度变化来判断是否呈阳性;另一种则是借助于相差显微镜观察，在相差显微镜的视野中，生长态细胞呈现暗色，而芽胞则呈现亮色。 对一特定的灭菌工艺而言，尽可能购买同一类型的生物指示剂，这样可以大大减少实验室花费在

29、生物指示剂的质量复核及灭菌工艺验证评价方面的工作量。三、制备如必要用环境中的分离菌来验证灭菌程序时，有条件的微生物实验室可自行制备生物指示剂，包括选种、大规模芽胞培养、收集芽胞、纯化和保藏等。菌种储备液内不得含有营养性物质以保证芽胞始终处于休眠状态。对自制生物指示剂芽胞的贮存条件和贮存时间应予验证，以确保芽胞数量和D值的稳定性。实验室自制生物指示剂时，应按生物指示剂生产商的规范要求制备生物指示剂。有关生物指示剂的记录均应具有可追溯性，如种源、转种时间、传代代数、培养及制芽胞用培养基和芽胞收集前后的热处理方式等。参照实验室菌种制备、保藏和使用要求管理灭菌工艺用生物指示剂。 四、生物指示剂的选择和

30、使用 一种生物指示剂不是万能的，要根据灭菌方式及工艺条件选择适当的生物指示剂。事先要了解生物指示剂对相关灭菌工艺的耐受性能，以保证所用生物指示剂的挑战性大于自然存在于产品内(或外)的微生物的挑战性。 生物指示剂对灭菌工艺的耐受性，不仅取决于生物指示剂本身，而且也取决于灭菌时其所处的环境条件，如生物指示剂包装材料对杀菌剂的穿透效果，芽胞溶液的pH值、粘度、金属离子的浓度等都是生物指示剂耐受性的主要影响因素。为了确保生物指示剂在产品灭菌程序开发、验证和日常监控中的有效使用，务必要充分了解相关产品的组分及其包装材料的性能。需要确保所用生物指示剂赋予产品灭菌工艺的挑战效果大于产品中实际污染菌的挑战性。

31、如果因产品对灭菌条件敏感而无法采用过度灭菌工艺，则要根据灭菌前产品的含菌量资料来制定合理的灭菌工艺条件和选择适当的生物指示剂。 灭菌工艺开发一、确立灭菌终点 任何灭菌工艺的目的都是为了完全杀灭所有微生物。但是，从微生物死亡的概率特性以及低污染水平下的检测难度来看，无法证明一个灭菌程序已将所有的微生物都杀灭了。那么，又该如何确定灭菌终点呢?无菌定义为:使微生物的残存概率下降到100，并在此基础上再下降6个对数单位(即微生物的残存概率不超过1/百万，或PNSU10-6) 灭菌过程中所产生的各项物理和生物学参数应能保证其灭菌效果达到PNSU=10-6。 如果N0和DT已知，为使灭菌终点达到10-6的

32、要求， FT =（1gN0-lgNT）DT 灭菌工艺开发所涉及的生物和物理学参数生物学因素物理因素1.灭菌前微生物量: N02.灭菌前微生物的耐热性: DT3.灭菌终点的残存概率: N0 (10-6)灭菌值:FT 例如，灭菌前半成品的每个容器内含有l00个耐热芽胞，其DT = 1分钟，进行湿热灭菌时，灭菌值F0要达到8分钟，才能使产品中的微生物降至100后，再下降6个对数单位:F0=2-(-6)x1=8分钟。F0=8分钟是灭菌工艺必须达到的最小目标值。也可根据灭菌设备的性能和产品的热稳定性确定F0的上限。二、控制灭菌前含菌的灭菌工艺(一)工艺概述严格地说，建立在含菌量控制基础上的灭菌工艺，其灭

33、菌终点是由灭菌前半成品的含菌量及所含微生物的耐热性来决定的。但是，生产时应避免产品被耐热性微生物污染，而不能依赖于最终灭菌。为此，有些产品在灭菌前进行无菌生产和灌装。 生产时，控制灭菌前产品中的含菌量，主要的好处在于可以降低灭菌条件，这样就可以降低灭菌时对产品及其容器/密封件的潜在破坏性。这对热敏性产品(如蛋白质)来说，是非常重要的。如果在灭菌前产品中没有耐热菌，为便于工艺开发，则可假设有一定数量的芽胞存在于其中(常规生产时可能会碰到的最差状况)。比如，可假设每只容器内含有D121=0. 5分钟的耐热芽胞l00个。开发工艺时，可根据与假设菌的数量及耐热性相当的实际生物指示剂(BI)来确定一个灭

34、菌工艺的灭菌效果。根据置于灭菌产品内的测温探头的测量数据计算出理论F0值，并对多次运行的F0值进行平均，将平均F0值与从接有生物指示剂(已知胞子数量和D值)的类似容器中得到的平均SLR值进行比较，根据生物指示剂的致死效果，估算出实际污染菌的下降水平: SLR A=SLRB DB/DA ,SLR A灭菌前产品中污染菌的对数下降值; SLR B生物指示剂的对数下降值; DA灭菌前微生物的(已知或假定的)D值; DB生物指示剂D值。 例，如果DA=0.5分钟，DB=2.0分钟，在121 ,灭菌值F0=8分钟，生物指示剂下降4个对数单位，则灭菌前微生物的数量可下降约16个对数单位: SLRA=4 (2

35、.0/0.5)=16, lgNT =1gN0-SLR=2-16=-14。 从图可以看出，在灭菌结束时仍有一部分生物指示剂未被杀灭，但这并不意味着此灭菌程序无效。相反，生物指示剂起到了“生物积分器”作用。通过它们，证实了测温探头指示的F0值8分钟)所赋予容器内物品的实际灭菌效果。有些厂家误认为，在进行工艺验证时，必须将耐热性最强的芽胞，以106浓度接入产品中，并且要下降6D或12D，才能认为此灭菌工艺有效。有时，生物指示剂在产品中的耐热性会有所增强，这就需要赋予非常大的Fo值才能将其完全杀灭。只要按下述方法对灭菌前的含菌量进行控制、监测并掌握其耐热性，此种做法是完全没有必要的。 (二)灭菌前产品

36、的微生物监控如果能严格执行GMP规范。那么无菌生产的药品中一般是不会含有耐热芽胞的。即使在非无菌条件下生产，灭菌前的产品中存在的微生物应只是为数不多的不耐热的生长态菌。对于非无菌生产的药品而言，必须对灭菌前产品的微生物进行监测，以确保半成品的微生物处于稳定的受控状态。监控方法是: 1.在灌装结束阶段取样。 2.对这些样品进行微生物计数。 3.将样品置于100下暴热10分钟后，过滤检查并进行需氧和厌氧条件培养，测定其中的总芽胞数。 应规定灭菌前产品中微生物含量的限度标准，对微生物计数资料进行趋势分析，以考察批与批之间稳定性。如果暴热后样品的检测结果与预期目标一致，即没有任何微生物生长，则说明在灭

37、菌前产品中不存在任何耐热芽胞。 一般情况下，暴热后的样品中是检测不到微生物的，一旦发现，则需对其鉴别并测定其D值。若分离菌的D值大于灭菌工艺验证所用生物指示剂的D值，则说明灭菌程序不充分，应采取措施以消除产品中的耐热菌。如果这些措施不可行，则应采用具有更强耐热性的生物指示剂，或是从产品中分离出的耐热性微生物，对灭菌程序进行再验证。三、过热灭菌及去热原工艺 采用过热灭菌程序时，不用考虑灭菌前含菌量问题。这并不意味着就不用对灭菌前含菌量进行控制。相反，遵照良好的卫生生产规范以控制灭菌前产品中的污染菌含量是非常重要的。 过热灭菌工艺是指能使D值不小于1.0分钟的耐热微生物(常指嗜热脂肪芽胞杆菌)在数

38、量上至少下降12个对数单位的灭菌工艺。过热灭菌工艺常用于热稳定性物品的灭菌，如包装材料和生产设备等。验证时，常常先通过确定完全杀灭含有106个嗜热脂肪芽胞杆菌的生物指示剂（D121值为1.5分钟左右)所需的灭菌时间，再将这个时间加倍即为实际生产时的过热灭菌时间。去热原工艺通常是和干热灭菌联系在一起的，去热原的工艺条件比芽胞杀灭程序要苛刻得多，通常是FH(干热致死时间)的数十倍。因此，如果干热去热原工艺能使细菌内毒素下降3个对数单位，那么就没必要再进行生物指示剂的挑战性实验。湿热灭菌工艺的生物学验证一、验证的标准 最终产品的无菌质量取决于两个因素，即灭菌前产品中的微生物含量以及灭菌工艺的杀灭效果

39、。微生物学验证就是在这两个因素的基础上进行的。 任何灭菌工艺均应当能使产品中的污染菌含量下降至一个菌之后，再下降6个对数单位，这样才能保证产品经灭菌后其中非无菌品的概率不超过1/百万。 生物学验证就是要用与产品灭菌工艺相适应的最苛刻条件来挑战该产品灭菌工艺的有效性、可靠性和稳定性。二、过热灭菌工艺(一)生物指示剂的选择对过热灭菌工艺是指能使D值不小于1分钟的微生物至少下降12个对数单位的灭菌工艺。对一般的液体产品而言，在121灭菌15分钟即被认为过热灭菌工艺。但对管路、胶塞、织物以及过滤器等热穿透性较差的物品则需要更长的灭菌时间或更高的灭菌温度，方能达到过热灭菌要求。用做生物指示剂的微生物芽胞

40、应具有良好的耐热性并且耐热性也相对比较稳定。 根据灭菌工艺对微生物的强热致死效应，通常选用D值不低于1.5-3.0分钟的嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞(每个指示剂的芽胞含量通常在l05-107之间)作为生物指示剂对过热灭菌工艺进行验证。该类指示剂在F0值低于其存活时间(D值芽胞数的对数值-2)时，应当能全部呈阳性结果;当F0值高于其杀灭时间(D值芽胞数的对数值+4)时，所有的生物指示剂均应呈阴性结果。 对Fo值为15分钟的灭菌工艺(药典推荐的常用灭菌工艺)，可选用D值为1.5分钟、芽胞含量为106个的生物指示剂，或其他耐热性相当的生物指示剂，对其进行验证。 根据被灭菌物品的性质来确认所选用不同包装方式的生物指示剂。灭菌溶液时，多选用自含型安瓶瓶生物指示剂;灭菌织物时，多选用芽胞条;灭菌管路时，则可能要选