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1、研究生必备设计引物篇一、引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA,在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中,Copy该编码序列作为软件查询 序列的候选对象。2、用 Primer Premier5 搜索引物 打开Primer Premier5,点击File.New.DNA sequence,出现输入序列窗口 Copy目的序列在输入框内（选择As,此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer,进入引物窗口。此窗口可以链接到“引物搜索”“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR prim
2、ers- “P设 air定s搜”索，区域和引物长度和产物长 度。在Search Parameters里面， 可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度 可以适当变化，因为100200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选 择300500bp.点击OK,软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating排序点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口 ”中,显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引 物的序列和位置，引物的各种信息等。对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3不，要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC
3、,否则容易引起错配。此窗口中 需要着重 查看的包括：Tm应该在5570度之间，GC%应该在45%55% 间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚 体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮 显示为红色，表示存在该 二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图 示。最理想的 引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为 好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比 如引物存在 错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明 显影响产物。对于引物具体详细
4、的评价需要借助于Olig。来完成Qig。自 身虽然带有引物搜索功能，但其搜 索出的引物质量感觉不如Primer5.在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物,然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair,使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档,里面有该引物的详细信息。3、用Oligo睑证评估引物在Qig。软件界面File菜单下，选择Open,定位到目的cDNA序列（在primer中该序列已经被保存为Seq文件，会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability(Delta G 窗口和 Tm口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮
5、，会出来引物定位对话框，输 入候选的上游引物序列位置（Primer5已经 给出即可，而引物长度可以通过点击Change口的Upper按钮,确定上Current oligo length来改变。定位后，点击Tm游引物，同样方法定位下游引物位置 点击Lower按钮，确定下游引物。引 物确定后，即可以充 分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。Analyze中，第一项为Key info,点击Selected primers会,给出两条引物 的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Olig。是采用 nearest neighbormethod计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗
6、口中还给出引物的Delta G和3,端的Delta G.3,端的Delta G过高,会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项 绝对值应该小一些，最好不要超过9oAnalyze中第二项为Duplex Formation,即二聚体形成分析，可以选择上 游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二 聚体情况，还可以选择Upper/Lower，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影 响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要 使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其DHtaG值应该偏低，一 般不要使其超过4.5kcal/mol,结合
7、碱基对不要超过3个。Oligo此项的分 析窗口中分别给出了 3,端和整个引物的 二聚体图示和De代aG值。Analyze中第三项为Hairpin Formation,即发夹结构分析。可以选择上 游或者下游引物，同样,Delta G值不要超过4.5kcal/mol,碱基对不要超过3 个。Analyze中第四项为Compos由on and T m,会给出上游引物 下游引物 和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC%需要控制 在40%60%,而且上 下游引物之间的GC%不要相差太大。Tm值共有3 个,分别采用三种方法计算出来，包括 nearest neighbor method、 % G
8、C method和2(A+T+4(G+Cmethod,最后一种应该 是Primer5所采用的方法,T m值可以控制在5070度之间。第五项为False Priming S让es,即错误引发位点，在Primer5中虽然也有 False priming分析但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错 误引发效率，一般的原则要使误引发效率在1。以下，当然有时候正确 位点的引发效率很高的话，比如达到40050。,错误引发效率超过100幅 度若不大的话，也可以接受。Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”在，此窗口中，是基 于此对引物的PCR反应Summary,并且给出了此反应的
9、最佳退火温度，另 外,提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二 级结构存在，并且Delta G值偏大的话Qig。在最后的评价中会注明，若 没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。引物评价完毕后，可以选择File.Print,打印为PDF文件保存，文件 中将会包括 所有Olig。软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数 页。因此，打印前最好关掉Tm口和DeltaG窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口 （若 存在可疑的异常的话和PCR窗口。4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析,一般来 说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游
10、引物和 下游引物的blast结果进行对比分析,只要没有交叉的其他基因的同源序 列就可以。二、引物设计过程中的心得1、Primer 5.0搜索引物Primer Length我常设置在18-30bp短了特异性不好，长了没有必 要。当然有 特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。PCR Product size最好是100-300bp之间，小于100bp的PCR产物琼 脂糖凝胶 电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛 刻。Search parameters 还是选 Manual 吧Search stringency 应选 High,GC 含 量一般 是40-60%o其它参数默认就可以了。
11、引物之间Tm值的差应下雨5、引物和模板之间的Tm值差应小 于20较合适。（在设计引物过程中个人的总结搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Olig。软件里评估。当 然搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端 三2个人或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端22个G或C,这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于 这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端 去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好2、Oligo 6.0评估引物在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下 游引物 之间,The most
12、 stable 3-Dim er 绝对值应小于 4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关， 我几次实验感觉在PCR退火温度在65的时候,The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol没有问题。Hairpin Formation根据黄金法则False priming sites: Primer 的 priming efficiency 应该是错配地方的 4 倍左 右，更多当然更好。在PCR栏,丁香园战友感觉其所显示的optimal annealing tempe
13、rature 数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范 围就可以了。Internal stabi肉很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边 低的弧 形，最起码保证3端不要过于稳定。下图引物3端过于稳定 很容 易导致不适当扩增。ZG参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放 到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以4G 绝对值越大结构越稳定。3、其他两个评价系统不一样，丁香园战友感觉olig。评价引物好点Rimer 出来的引物，一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到 oligo测试。这是初步的选择,其实引物到了 olig。里,退火温度也不一样。3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50。的退火温度肯定和65对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在4.5kcal/mol以下（丁香园战友观 点很多东西真得还是需要自己摸索。丁香园战友感觉3端有A无A影响不大,3端有T是不是一定不行， 不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1+1=2那么确定。喑配和二聚体谁轻谁重，丁香园战友觉得“到致命的程度刀谁都重要，在设计的时候，尽量两个都不得罪GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以丁香园战友设计引物的时候, 会尽量避免这样的情况出现。