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1、产核黄素枯草芽孢杆菌中心碳代谢的代谢工程产核黄素枯草芽孢杆菌中心碳代谢的代谢工程 本文以代谢工程的理论为指导,围绕产核黄素枯草芽孢杆菌的中心碳代谢进 行遗传改造,以减少酸性副产物乙酸的生成,提高碳的转化率,并构建了一系列的 产核黄素枯草芽孢杆菌的基因工程菌,比较系统地研究中心碳代谢的的遗传改造 对枯草芽孢杆菌的核黄素生物合成的影响,得到的主要结果如下:1.建立产核黄 素枯草芽孢杆菌的代谢网络模型,进行了通量平衡分析和代谢通量分析的对比。 发现枯草芽孢杆菌的核黄素得率最大时,不产生酸性代谢物乙酸、乳酸和丙酮酸 等,并预测进一步遗传改造的靶点。 2.构建了 pta 基因缺失的产核黄素工程菌,pta
2、 基因缺失工程菌与其亲株相 比,pta 基因缺失使得菌体生长缓慢。代谢分析表明, pta 基因缺失减少乙酸的生 物合成,伴随着丙酮酸积累。 随后在 pta 基因缺失工程菌中扩增 alsS 基因,发现 alsS 基因扩增使得枯草 芽孢杆菌有能力将丙酮酸导向 3-羟基丁酮生物合成途径,降低丙酮酸的积累,同 时改善了菌体的生长,可在0.5%葡萄糖基本培养基积累核黄素54.4 mg/L,比出发 菌株 RH33:pRB63_n 提高了 85.7%。遗传改造后代谢通量分析表明,中心碳代 谢的遗传扰动对代谢网络关键节点的通量分配影响很小,但这些微小变化促进核 黄素生物合成途径通量的改善。 3.研究了 gdh
3、 基因的扩增对枯草芽孢杆菌核黄素生物合成能力的影响。 结果 表明:扩增 gdh 基因使得菌株在 0.5%葡萄糖基本培养基积累核黄素 37.2 mg/L, 比出发菌株RH33:pRB63_n 提高了 29.7%,同时降低酸性副产物生成速率,这表 明提高葡萄糖酸支路的通量有利于核黄素的积累。 4.对磷酸葡萄糖异构酶靶点进行遗传改造,构建 pgi 基因缺失工程菌。通过 对其发酵和生长的研究得出结论:pgi 基因缺失使菌体生长缓慢,利用葡萄糖的 能力降低,但当培养基中添加适量酵母抽提物时,可以改善菌体生长和糖的利用, 可在 0.5%葡萄糖基本培养基积累核黄素 35.9 mg/L,比出发菌株提高了 25.1%。 5.6-磷酸葡萄糖节点的代谢控制分析表明,降低糖酵解的通量能有效地提高 磷酸戊糖途径的通量。