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1、实验九 微生物生理学实验（一） 酵母菌对糖类的发酵和对氮源的利用一、目的要求1. 学习测定酵母菌对糖类发酵和对氮源利用的方法；2. 学习并掌握微生物接种的无菌操作技术。二、基本原理酵母菌对各种糖类的发酵能力差别甚大，这是酵母菌分类鉴定的重要依据，也是酿造工业中鉴别培养酵母和野生酵母的一种方法。由于酵母菌发酵糖类能生成乙醇和CO2，因此可以在加糖的培养基中培养酵母菌，通过观察有无气体生成来判断酵母菌能否发酵该糖。不同的酵母菌，由于其体内酶系不同，对不同氮源物质的利用能力也不尽相同。了解酵母菌对氮源物质的要求，不但有助于对酵母菌进行分类鉴定，而且对发酵培养基的设计也可提供依据。在无氮的基础培养基中
2、添加一种氮源物质作唯一氮源，并接种酵母菌进行培养。根据酵母菌能否生长及生长的程度可以判断酵母菌对该氮源物质能否利用及利用的能力。三、实验材料1. 菌种：酿酒酵母 2. 培养基：糖发酵管（无碳基础培养基+2%待测糖，内含倒置杜氏小管）；氮源利用培养基（酵母无氮基础培养基+0.5%待测氮源） 3. 其它：酒精灯，接种环等四、操作步骤1. 酵母菌对氮源的利用1）接种：a) 操作前，先用75%酒精擦手；b) 取各种待测氮源培养基斜面和对照各1支，用75%酒精擦洗后，置于无菌工作台的试管架上，然后开启无菌工作台，点燃酒精灯。c) 取菌种管和待接种的培养基管各1支，握于左手的大拇指和其他四指之间，使斜面向
3、上，并处于水平位置。d) 先将两支试管的塞子轻轻旋转一下，然后用右手的手指夹住试管塞的端部将其拔出，并将试管口在酒精灯火焰上旋转加热（试管塞不得任意放在操作台上或与其他物品相接触，也不得用手握住其插入试管内的部分；试管口要一直置于酒精灯火焰的保护下）。e) 将接种环由下至上在酒精灯火焰上加热后伸入菌种管内，先在试管内壁或未长菌苔的培养基表面接触一下，使接种环充分冷却。然后用接种环在菌苔上轻轻地接触，刮出少许培养物，将接种环自菌种管内抽出（取菌时不要将原培养基带出，也不要菌量太大，以免影响结果；抽出时勿与管壁相碰，也不要再通过火焰）。f) 迅速将沾有菌种的接种环伸入培养基管内，在斜面上自下而上轻
4、轻划直线即可（划线时不要用力，不得将培养基表面划破）。g) 将接种环抽出，在酒精灯火焰上灼烧试管口，塞上试管塞。h) 将接种环在火焰上灼烧灭菌后放回试管架上，然后将试管塞进一步塞紧，将已接种的培养基管放回试管架，并取出另一支培养基管进行接种，直至将所有培养基管全部接种（操作熟练后也可同时取几支试管接种）。2）培养：将上述接种好的各试管置于25培养57天。3）结果观察：观察酵母菌在各种培养基上的生长情况，并与对照管比较，判断酵母菌能否利用各种氮源物质，并记录。2. 酵母菌对糖类的发酵1) 接种：取各种糖发酵管和对照管（不加糖）各1支，按无菌操作要求接种（和前述方法基本相同，但使试管口略高一些，以
5、免液体培养基流出）。接入菌体后，使接种环与管口内壁（靠近液面处）轻轻地研磨将菌体擦下。接好种后，塞好试管塞，将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散（不可剧烈振荡，以免将气泡摇入杜氏小管）。2) 培养：将上述接种好的各试管置于25培养57天。3) 结果观察：观察各管的杜氏小管中有无气泡形成。若有气泡形成，说明能发酵该糖；反之，说明不能发酵该糖。记录实验结果。五、演示微生物接种的无菌操作方法。六、实验内容1. 检测酿酒酵母对葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的发酵情况；2. 测定酿酒酵母对硫酸铵、硝酸钾、尿素的利用情况；七、实验报告1. 观察并记录酿酒酵母对葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的发酵情况；2. 观察
6、并记录酿酒酵母对硫酸铵、硝酸钾、尿素的利用情况；3. 你的实验结果和理论上的解释能否统一起来？若不统一，请分析原因。（二） 细菌的生理生化反应（V.P. 试验、甲基红试验）一、目的要求了解细菌鉴定中常用的主要生理生化反应试验法及其原理。二、实验材料1. 菌种：大肠杆菌（E.coli）、产气杆菌(Enterobacter aerogenes)2. 培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基3. 试剂：甲基红试剂，40%NaOH溶液，肌酸三、基本原理大肠杆菌和产气杆菌均为革兰氏阴性杆菌，大肠杆菌是肠道寄生菌，产气杆菌广泛存在自然界中，因此检查水时要将两者分开。V.P.试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或
7、中性末端产物的能力，如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即V.P反应为阳性。产气杆菌V.P反应为阳性。甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色（pH6.3）变为红色（pH4.2）即甲基红反应为阳性。大肠杆菌甲基红反应为阳性。四、操作步骤(一) V.P.试验1. 试管标记 取3支装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，分别标记大肠杆菌、产气杆菌和空白对照。2. 接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至
8、以上相应试管中，空白不接菌。置37恒温箱中，培养2448h。3. 观察记录 取出以上试管，振荡2min，另取3支试管相应标记菌名，分别加入23ml对应管中的菌液，再加入V.P.试剂1015滴，并用牙签挑入约0.51mg微量肌酸，振荡试管，放在37恒温培养箱中保温1530min后，若培养液呈红色，记录为阳性反应，若不呈红色，则记为阴性。(二) M.R试验V.P.试验留下的培养液中，各加入23滴甲基红试剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变为红色，即为阳性反应，若仍为黄色，则为阴性反应。五、实验报告1. 大肠杆菌和产气杆菌V.P试验和M.R实验的结果。2. 在V.P反应中加入NaOH溶液的作用是什么？3. 还有哪些生理生化反应能用于鉴别大肠杆菌和产气杆菌。