蛋白质的裂解.ppt

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1、第五章蛋白质的裂解,用Edman降解法测多肽链的氨基酸顺序，一次只能连续降解数十个残基，用手工方法最多测二十多个残基。然而，自然界蛋白质的分子量通常在一万以上，因此在测多肽链顺序时，需将它们先裂解成一系列小肽，分别测出它们的顺序，然后再找出它们的接头位置，才能定出该肽链的顺序。所以如何选择肽链裂解的切点，将对顺序测定起着重要作用 裂解条件要求： 裂解点少 专一性强 反应产率高 裂解方法： 酶法 化学法 酶解和化学裂解是顺序分析中互为补充缺一不可的手段,一、 引 言,早期：部分酸水解法裂解，由于专一性 低，裂解后生成很多小肽，造成 分离纯化困难，工作量也很大。 中期：生化学家改用蛋白酶酶解，因专

2、 一性强，故被广泛地使用。 后来：随着自动顺序仪的广泛使用和对 大肽段的需求，发现某些化学试 剂对蛋白质的裂解有特异的优点。 化学法再流行。,（）简述 用特异性水解酶裂解肽链有许多优点：专一性强，降解后的肽段容易纯化，产率较高，副反应少，在酸水解中容易受破坏的谷氨酰氨、天冬酰氨和色氨酸等在酶解中都不受影响。 整个酶解反应中，酶解条件的选择相当重要，需要考虑下列因素： （1）合适的pH （2）适宜的反应温度 （3）恰当的酶与底物的比率 （4）选择相应的反应时间,二、蛋白质的酶裂解,最常用的水解蛋白酶，专一性强,只断裂赖氨酸和精氨酸的羧基所形成的肽键，用它裂解蛋白质常常可得到合适的肽段,商品胰蛋白

3、酶中，常含有少量胰凝乳蛋白酶，这样，在酶解时会产生不希望有的肽片段。因此，使用前需用L-1（对-甲苯磺酰）苯丙氨酰氯甲酮（简称TPCK） 处理胰蛋白酶，以抑制胰凝乳蛋白酶的活力。也可直接订购用TPCK处理过的胰蛋白酶。,1、胰蛋白酶,讨论： 如果蛋白质分子量较大，或遇到碱性蛋白含有较多的赖氨酸和精氨酸残基时，则酶解后的肽段数就会很多，将给顺序测定带来很大麻烦。 方法：用柠康酸酐可逆保护赖氨酸的-氨基，使胰蛋白酶酶解时不会在赖氨酸羧端裂解，而只在精氨酸的羧端裂解，以后也很容易去掉保护基团。,-氨基保护剂,凝凝乳蛋白酶的前体是胰凝乳蛋白酶原，由245个氨基酸组成的单链，有5个二硫键。酶原本身没有水

4、解活力，靠胰蛋白酶激活，在Arg15-Ile16 肽键处水解，形成 - 胰凝乳蛋白酶。 而-胰凝乳蛋白酶又反过来对本身起作用，酶解掉二个二肽 Ser 14- Arg15 和 Thr147 - Asn148，生成具完全活力的 a-胰凝乳蛋白酶。 因此a一胰凝乳蛋白酶由A、B、C三条多肽链组成，它们分别含有13，130，96个氨基酸残基。,2、胰凝乳蛋白酶,凝凝乳蛋白酶的专一性不如胰蛋白酶， 酶解Tyr，Phe、Trp、Len等疏水氨基酸羧基所形成的肽链， 也能在val、Ile、Ser、Gly的羧端裂解，但较慢。如果被裂解的邻近基团是碱性的（如Lys、Arg或His），裂解能力将增加。倘若邻近是P

5、ro或PhePro，则不能酶解。 在酶解中，增加酶的比例（对底物）能提高酶解能力，这时，甚至象Ala-val键也能酶解。,凝凝乳蛋白酶,专一性与胰凝乳蛋白酶类似 适宜酶解pH值是2 在顺序测定中很有价值，因为在确定二硫键的位置时，在这样的酸性环境下二硫键比较稳定，很少有二硫键的互换反应。反应条件选择恰当，可以变低特异性为高特异性。,在pH2.5的水溶液中，用胃蛋白酶酶解胰岛素于3冰水浴恒温反应1.5h，此后用lN NaOH调pH=9以终止反应。结果用Scphadex G-50柱（3.0110cm）分离得到了很纯的去B链羧端五肽胰岛素，说明胃蛋白酶在酶解中只降解胰岛素B链中第25位苯丙氨酸的羧基

6、所形成的肽键（Phc25- -THR26-Thr27-Pro28LyS29-aLA30）,3胃蛋白酶,含金属的酶，锌原子和钙原子，锌是活力所必需的，钙使酶在高温下稳定，该酶易被EDTA所抑制。 专一性比上面三种酶都差，用来直接酶解蛋白质不太合适，因为产生的肽段相对较多，不仅纯化起来麻烦，而且对以后的顺序重排也不利。如用它来裂解次级肽，即先用专一性较强的酶或化学试剂把蛋白质多肽链降解成大肽段，再切成小肽段时，嗜热菌蛋白酶可发挥很好的作用。 胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶有一个共同的特点，即它们的作用范为比较宽，并且主要裂解中性氨基酸残基。,4. 嗜热菌蛋白酶,（三）几种高特异性的肽链内切酶

7、 在蛋白质顺序测定中，对较大分子量的蛋白质采用逐级特异性裂解是比较理想的。,Glu蛋白酶 Glu蛋白酶亦称金黄色葡萄球菌蛋白酶，是从金黄色葡萄球菌菌株V8中分离得到的，是最有效、应用最广泛的一个酶，分子量只有12,000。 当酶解在磷酸缓冲液（pH7.8）中进行时，它能在谷氨酸和天冬氨酸残基的羧端处裂解肽键。 用碳酸氢铵（pH7.8）或醋酸胺（pH4.0）时，则仅在谷氨酸的羧端处裂解。 该酶对下列蛋白质只在谷氨酸的羧端处裂解：核糖体蛋白S7，L23，EL12，维生素A1结合蛋白,钙结合蛋白，a1lll胶原蛋白, 2小球蛋白。,Arg 蛋白酶 （1）Chostripain 酶 专一性裂解精氨酸羧

8、端的蛋白酶。 专一性很高；肽链的羧端是精氨酸；该酶在6mol l尿素20小时内仍保持活力，这样对不溶性蛋白质 的长时间裂解就很有效。 （2）凝血酶（thrombin）是另一个作用精氨酸羧端的 特异酶, 对Arg-Gly 键裂解特别快。 (3) 颌下腺蛋白酶也有裂解精氨酸所形成的肽键的专一 性, 对磷脂酰胆碱交换蛋白只裂解Arg-Glu键，对 血纤维蛋白原只裂解Arg-Arg键。,Lys 蛋白酶 选择性一般不如Arg蛋白酶专一 1）密环菌（Armillaria mellea）是裂解赖氨酸氨端肽键,条件是在赖氨酸残基的羧端必须联有谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺残基。这个酶对精氨酸也具有活力，如在酶解天

9、冬氨酸氨转移酶时，发现它在部分赖氨酸残基氨端裂解外，还同时裂解三个Arg-Leu（Ile）键 2）血纤维蛋白酶裂解血纤维蛋白原时也发现除裂解部分的赖氨酸外，也裂解精氨酸氨端肽键 3) Myxobactcr AI-1是另一种Lys蛋白酶。 它是从一种粘细菌中提取的，也能在赖氨酸残基的氨端裂解，条件是，赖氨酸残基的羧端通常联有Tyr，Ala和Gln残基 4) 凝血酶样酶（thrombin enzyme) 是 Lys-Leu键的高特异性Lys蛋白酶。,Pro蛋白酶 特异性在Pro羧基所形成肽键处裂解的 蛋白酶，从小羊肾中提取,（四）实验方法 1. 胰蛋白酶裂解 （l）TPCK一胰蛋白酶降解 称1.0

10、mg蛋白质 + 0.5ml双蒸水 + 0.5m1 0.2moll N-甲基吗啉缓冲液（pH 8.1） + 10-20 ug TPCK-胰蛋白酶 37保温反应4-6h 冷冻干燥 加50ul双蒸水溶解，离心 上清液待分离纯化后供测顺序用,胰蛋白酶（200mg） 溶于62 m1 0.001mo1l CaCl2 用3% NaOH 调pH至7.0 在15-20加人含6mg TPCK 0.6ml无水甲醇溶液 继续搅拌 维持pH7.0 约5.5h 用pH3.0的盐酸水溶液透析2.5天 然后冻干。,（2）TPCK处理胰蛋白酶,分离纯化,（3）TPCK一胰蛋白酶活力的测定方法 称底物苄酰L-精氨酰乙酶盐酸盐（B

11、cnzyl-L-Argininc cthv1 csterH C1 简称 BAEE) 3.9mg 溶于10ml 0.05moll Tris缓冲液（pH9.24）中，将TPCK处理过的胰蛋白酶 l mg 溶于10 m1 0.001N HCI中，吸底物3ml在紫外分光光度计上（波长253nm处），调节光密度为0，然后加人0.2ml 酶液。每隔30秒钟读一次光密度数，直至读数不变为止，一般在10分钟内稳定。 活力单位计算公式： a.u. = -,O.D.,C酶,（4）保护Lys -NH2的方法 柠康酰化法： 蛋白质 溶于6moll 盐酸胍或 8 moll 尿素（20-30mg 蛋白质ml） 在室温（2

12、0）下 用12 N NaH 调pH 至8.0 柠康酸酐25mg（10倍于蛋白质的量） 激烈搅拌2小时，pH 8.5 左右 透析或用Sephadcx G-25柱除试剂和盐,分离纯化, ETPA法：以ETPA与溶菌酶反应为例 蛋白质 硼酸缓冲液（ 0.2mol/l pH=8.8） 12 mg 蛋白质 /ml， 过量的ETPA（按参与反应的Lys基团数计算） 12倍，搅拌下分批滴加 用l N NaOH pH = 8.59.0 加入ETPA时，产生沉淀 2小时反应结束 4 透析 (pH= 8, 5(w/v)NH4HCO3),分离纯化,马来酰化法： 称蛋白质 (200 mg) 溶于10 ml的 0.lm

13、oll磷酸钠缓冲液 冰浴冷却 滴加300mg马来酸酐 （溶于3ml无水三氧六环） 用0.1 N或0.5N NaH pH= 9.0 0下放置30 min 继续搅拌 1h 室温透析48h（外透液为2N氨水, pH8) 冷冻干燥,分离纯化,2. 胰凝乳蛋白酶裂解 : 酶解条件及缓冲液与胰蛋白酶相同, pH8.1，37，酶:底物=1:100，酶解1-4h 3. 嗜热菌蛋白酶裂解: 缓冲液与胰蛋白酶相同 pH8.1，50-55 酶:底物=1:100或1:150，酶解2h 以避免胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的副反应,4胃蛋白酶裂解 : 1.0 mg蛋白质 + 0.5ml 0.05N 醋酸或稀甲酸中, pH 2.

14、0 + 10ug 胃蛋白酶（溶于10ul双蒸水） 37下搅拌反应 2h 冰冻干燥 随后溶于50ml双蒸水中 离心,分离纯化,5. Gul蛋白酶裂解: 蛋白质 1.0 mg 溶于1.0 m1 醋酸铵缓冲液 0.1mol, pH4.0 加20 ug Glu蛋白酶（溶于20 ul 双蒸水） 搅拌 酶:底物=1:50 37下保温24-28小时 冰冻干燥 加50ul 双蒸水溶解,分离纯化,6. Arg 白酶裂解: 蛋白质 1.0mg 溶于 1.0ml 双蒸水 加8.0 ug Arg 蛋白酶（溶于20ul 双蒸水） 37下搅拌反应1-4小时 冰冻干燥 再溶于50ul 双蒸水 待分离纯化,分离纯化,7.密环

15、菌蛋白酶裂解: 蛋白质 1.0mg 溶于0.5m1 0.1mol/l 1N - 甲基吗啉醋酸缓冲液 或 0.07氨水 （pH8.1） 1 ug 酶 溶于5 ul 双蒸水 （酶:底物 = 1:1000） 37下搅拌反应 4-6h 冷冻干燥 50 ul 双蒸水溶解 分离纯化供测顺序用,三、蛋白质的化学裂解,是蛋白质顺序测定中的另一重要手段 产物的肽段一般都比较大 裂解产物适合于在自动顺序仪中测定顺序 产物有利于肽段的吻合 因此化学法对较大分子量的蛋白质顺序测定是重要的,缺点：因为化学裂解后的肽段较大。往往会遇到不溶解和集聚等问题，分离较困难，产率一般也比酶解为低。,1原理 。溴化氰（CNBr）裂解

16、法是多种化学法中最重要的 也是最常见的方法。 。由Gross和Witkop于1962年建立的。后人进行了系统 研究, 能专一裂解蛋氨酸残基的羧端，产率达到85% 。由于蛋白质中的Met一般都比较少，因此裂解后的肽 段较少，新生成的肽段往往是大肽段，这样很适合于 自动顺序仪测定，更适用于固相法测定。与胰蛋白酶 裂解法配合起来，通常很容易获得肽段的排列顺序,（）溴化氰裂解,CNBr裂解蛋氨酸残基的反应机理：,CNBr 裂解肽链的甲硫氨酸羧基所形成肽链的反应,在酸性条件下氨基质子化，可以避免一些副反应 如：用70甲酸可以破坏肽链的卷曲，使甲硫氨酸侧链暴露，有利于CNBr的裂解 甲硫氨酸的氧化产物亚砜

17、Met(SO) 或砜Met(SO3)不能与CNBr反应 为防止甲硫氨酸被氧化，整个反应应在氮气流或充氮容器中进行 当甲硫氨酸在N末端，则产生游离的高丝氨酸内酯：,当肽链中有二个相邻的甲硫氨酸，则产生一游离高丝氨酸内酯和二个新肽段：,当甲硫氨酸在C末端，则C末端变为高丝氨酸内酯：,2. 实验方法 蛋白质 70%甲酸中 （5-50mg蛋白ml 70甲酸） 加30 -100倍过量 CNBr 通N2充分混合后 室温（20）黑暗处放置24h 加10倍量双蒸水稀释 冰冻干燥,或用70三氟 醋酸代替甲酸， 25反应12h， 然后用双蒸水 稀释到5%三氟 醋酸以终止反 应,分离纯化,注意，如样品溶解度差，可,

18、3 讨论 当甲硫氨酸在N末端时，反应常不完全，约有10Met键保留下来，不被裂解，其原因是由于O-乙酰基取代了N一乙酰基。,（二）羟胺裂解 1原理 NH2OH 能专一地裂解 Asn-Gly-之间的肽键，其反应机理是：通过NH2OH作用先形成一个琥珀酸亚胺环状物，最后导致Asn-Gly-键的裂解，反应式如下：,CONH2 CH2 OH- - HN-CH-CO-NH-CH2-CO-,例如：用NH2OH裂解DNA依赖的RNA聚合酶的 -亚基， 裂解后用Sephadex G100柱分离得到二个肽段， 一段是N端肽1 208 残基， 另一段是C端肽209 - 329残基。 如没有这一步裂解，中间这段顺序

19、将很难测定,2实验方法 蛋白质 (1-5mg/ml) 2 mol/l羟胺溶液（含6 mol/l胍 ），45保温 LiOH 4.5mol/l调节pH 到9.0 放置4-5h 9甲酸将pH调至2-3以终止反应。 用Sephadex G-25 或Bia - Gel P-2脱盐 在Sephadex G-75柱上纯化。,3 讨论 发现，当在pH2.5用NH2H裂解Asp-Pro键时产率能达到80。根据统计，每841个残基中Asp-Pro键出现的几率为1-2，实际上常达到3-4。 用盐酸羟胺裂解Asn -G1y的产率一般为50 - 80。在降解反应中，即使有其它副反应，也是很低的，通常不会对混合肽段的纯化

20、产生影响。在蛋白质氨基酸顺序中，Asn-Gly键出现的几率是很低的，平均每150个肽键也不一定出现一次。所以用这个方法降解产生的片段肽都很大，它对分子量大的蛋白质的测定是十分有用的。,1.原理 蛋白质顺序测定中，在色氨酸位点裂解也是常用的方法。1970年以前，裂解色氨酸的主要试剂是N溴代琥珀酰亚按（简称NBS）或类似的强氧化剂。产生副反应较多，在裂解中，除色氨酸外，邻近的组氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸也同时受到裂解。 后来改用BNPSSkatole，其对色氨酸裂解的专一性比NBS的高，产率通常在 50-70，缺点是试剂不太稳定。裂解反应通常在醋酸溶液中进行，若用高质量的新鲜试剂，副反应仅仅

21、表现为对Met的氧化，并使半胱氨酸氧化成胱氨酸。,（三）色氨酸位点的裂解,用醋酸/12盐酸/二甲基亚砜（DMSO）混合物，再加48%的溴化氢与蛋白质反应更具有专一性，并能限制甲硫氨酸和半胱氨酸的侧链氧化。 反应过程是先由DMSO与盐酸作用形成Me2S+Cl， Me2S+Cl反过来再氧化色氨酸中的吲哚环，再与DMSO/HBr作用形成溴化物，然后再裂解。,2实验方法 细胞色素C（17mg） 冰醋酸（600ul）、12N HCl（300ul）和 DMSO（25ul） 室温 溶解 加苯酚 200mg 30分钟 加 HBr 48% （100ul）和DMSO（25ul） 室温放置30分钟， 加水 2 rn

22、1 用乙酸乙酯提取，以除去血红素和它的分解产物 将水溶液减压浓缩， 用超细聚Sephadex G -50（2144cm）分离，用10%甲酸洗脱 部分收集,（四）部分酸水解 l.一般情况介绍 这是Sanger早年测定胰岛素顺序时曾使用过的方法。在引入特异性配裂解后， 部分酸水解法遭到了冷落，人们很少再使用它。但后来又发现部分水解法还是有一定的专一性，如用0.23 mol/l 醋酸与蛋白质回流时，可以使其中的天冬氨酸部分水解而被释放，其反应式如下： x-y-Asp-w-z x-y 十 Asp w-2 这里x、y、w、z代表任何其它氨基酸（Asn先水解为Asp，再部分水解）。,H+,（1）蛋白质 25mg 加0.25mol/l醋酸 20ml， 密封管中 110水解86h 冷冻干燥。,（2）蛋白质 pH2.5 （用10醋酸调） 或70-90甲酸溶液 （含有7moll 胍） 40保温反应4-5天 冷冻干燥。,2实验方法,分离纯化,分离纯化,1）根据现有的设备条件以及样品本身的特性和量 的多少选择裂解方法 2）考虑到裂解后肽段的分离纯化的难易程度选择裂解 方法 3）裂解还要考虑下一步肽链连接点推断的合理性选择 裂解方法,小结 选择裂解方法,谢谢大家！,