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1、乳液 PCR 法扩增复杂基因序列方法的建立,生物化工与环境工程学院 学生：徐敏轩 指导教师：张红琳 周东蕊,研究背景、目的与意义,目的 建立乳液PCR(ePCR)方法,解决普通PCR（cPCR）方法的瓶颈问题,乳液PCR 普通PCR,背景 PCR技术作为一种特异性DNA体外扩增技术，具有实践证明了的诸多优点，但普通PCR在一定方面存在偏向性，实验方法依然有待进一步完善,意义 通过建立乳液PCR(ePCR)方法解决普通PCR存在的问题，为体外扩增特异性DNA提供了新的实验方案，弥补了国内空白,普通 PCR 方法的优越性与局限性,cPCR,操作 简便,快速 用时少,经济 价格低廉,样本DNA 数量
2、少,灵敏 度高,重复 性好,特异 性强,样品处理简单,乳液 PCR 方法与普通 PCR 方法的基本原理比较,Droplets in Oil,ePCR,AP,Oil,AP,Oil,T,Min,cPCR,Oil,Oil,Oil,3步PCR,Oil,仪器与试剂,磁棒(38mm),旋涡振荡器(1700rpm),低温冷冻管(1.8 ml),主要仪器,凝胶成像系统Syngene,GS-800灰度扫描仪,水平电泳仪PAC3000,主要试剂,乙醚（水饱和）,小牛血清白蛋白(BSA),Mineral oil,Tween 80,Span 80,人工乳酸菌质粒,Forward primer,Reverse prim
3、er,Triton X-100,Oil,PCR buffer,dNTPs,DNA polymerase,Mg2+,ddWater,cPCR,ePCR,实验方法与步骤,乳液PCR油相制备,乳液PCR和普通PCR水相制备,乳液制备,PCR扩增,水饱和乙醚制备,破乳,扩增产物检测,实验 准备 部分,实验 实施 部分,样品配比,1,2,7,3,4,6,5,实验结果,1 乳液PCR油相制备,50ml离心管，在25oC条件下表1配制（2份油相）,移取750l油相,375l,375l,1700rpm持续搅拌,2 乳液PCR和普通PCR水相制备,1.5ml离心管，25oC条件下表2配制 （每个样品3个平行+1
4、空白）,3 乳液 PCR 乳液制备,OIL 50ml,乳液PCR AP 300ul,750ul,375ul,375ul,150ul(含BSA),150ul(不含BSA),水油体积比 1：2.5,含BSA乳液,不含BSA乳液,水相逐滴加入 2min内加完1700rpm，5min,样品配比,普通PCR AP 150ul,空白50ul,ePCR 乳液（不含BSA） 150ul,ePCR 乳液（含BSA）150ul,按每管50ulPCR体系加入PCR管中（10管），每个乳液PCR管中加入10ul石蜡油,普通PCR,乳液PCR,4 PCR扩增,反应条件(30轮)，按表3所列温度条件与循环次数进行扩增,3
5、0轮,5 水饱和乙醚的制备,无水乙醚,ddwater,10ml,10ml,1:1,30min,水饱和乙醚,ddwater,6、7 破乳与 PCR 产物检测,ePCR 乳液,离心,5min,25oC, 13000rpm,去上层 石蜡油,每管中加入等体,积水饱和乙醚,漩涡震荡,25oC, 13000rpm,离心,5min,破乳,ePCR 水相,去上层油相,2-3次,cPCR 水相,2%琼脂糖,凝胶电泳,真空干燥,ePCR 水相,去乙醚,成像分析,实验结果,1 乳液PCR与普通PCR扩增产物,230bp,2 无BSA的乳液PCR扩增产物,M,3 不同PCR反应体系温度下的扩增产物,25oC,30oC
6、,35oC,20oC,15oC,10oC,分析讨论,1 乳液PCR与普通PCR扩增产物分析,2 不同水油比对乳液质量的影响,3 BSA对乳液PCR扩增产物的影响,4 乙醚对破乳过程的影响,5 PCR反应体系温度对扩增产物的影响,1 乳液PCR与普通PCR扩增产物分析,普通PCR的三个平行样本都带有不同程度的拖尾和杂带出现，分析可能为引物二聚体，异源双链或者其他非特异性的碱基序列 在相同条件下乳液PCR由于其反应存在于微球体系中，PCR过程中扩增特异性强，减少了拖尾和非特异性片段的扩增产物的出现,230bp,2 不同水油比对乳液质量的影响,配置乳液时搅拌子转速控制在1500rpm-1800rpm
7、为最佳，过高则油相不易包被水相且易被打散，过低则会包被混合不均匀,高质量的乳液呈奶油白色，混合均匀，经3h-5h放置不会出现分层现象即为优质乳液，若乳液呈现灰白色或着清亮半透明色，且有或经PCR后分层则为低质量乳液,灰白色（1:2）,乳白色（1:2.5）,分层（1:3）,乳白色,1700rpm,1700rpm,3 BSA对乳液PCR扩增产物的影响,BSA作为Taq 酶的稳定剂在乳液PCR中起到了保护和帮助DNA聚合酶反应的作用，当没有BSA加入时，只有少量或没有扩增产物出现，分析原因可能是在油相中存在一些未知的大分子蛋白，这些蛋白在DNA聚合酶作用是会抑制或停止其催化作用导致只有少量或没有扩增
8、产物出现,BSA对DNA扩增影响示意图,TAQ酶,未知杂蛋白,无BSA,有BSA,BSA,4 乙醚对破乳过程的影响,无水乙醚是有节制的溶于水中（6.9g /100ml），若破乳时采用无水乙醚则会吸取样品水相中的水，导致水相减少甚至没有水相。,5 PCR反应体系温度对扩增产物的影响,琼脂糖凝胶电泳显示不同温度条件下（10oC，15oC ，20oC，25oC，30oC）的乳液PCR扩增产物含量不同,在25oC条件下，乳液PCR获得了较好的扩增效果，由此可以看出温度对乳液PCR扩增产物的含量具有非常重要的影响,小结,4 比较成功的解决了普通PCR方法在一定条件下特异性差的瓶颈问题，为后续实验提供了可靠的数据保证,目的,方法 步骤,结果 分析,应用 发展,1 通过乳液PCR方法与普通PCR方法的比较，建立了乳液PCR法扩增复杂基因序列的方法,2 讨论了乳液PCR法油相的制备方法，水相的配比，破乳的过程以及不同水油比例对扩增产物的影响,3 研究发现当加入100g/L的BSA时，水油体积比在1：2.5时，破乳水饱和乙醚体积比为1：1时，水油相混合在5min,1700rpm条件下得到了最佳的扩增效果,致谢,对于本论文的完成，我非常感谢我的指导老师张红琳老师对于我的悉心指导，感谢各位答辩老师的中肯点评，同时也要特别感谢谈冰畅,周围等同学给予我的大力支持和帮助，衷心的感谢大家。 谢谢！,