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1、大珠母贝 CCT-a、CCT-B禾口 CCT-n亚基基因全长 cDNA的克隆及 其冷应激表达 大珠母贝是生产大型海水珍珠的重要母贝 ,对海水温度的要求严格 , 生活的 适温范围是2530C ,不耐低温，了解大珠母贝对环境低温的反响机制有重要意 义。本研究首次克隆到大珠母贝冷应激相关基因CCT-a、CCT-B和CCT-n基因cDNA序列全长，并对其在不同组织和急性冷应激下的表达模式进行了分析，以了解大珠母贝的低温反响机制 , 也为大珠母贝的耐寒性状选育工作提供参考。结果如下：1.大珠母贝CCT-a、CCT-B和CCT-n基因cDNA全长克隆和生物 信息学分析利用RACES术首次从大珠母贝中克隆获
2、得 CCT-a、CCT-B和CCT- n基因cDNA全长。CCT-a基因cDNA全长1803bp,开放阅读框为1608bp,编码535 个氨基酸,在赤道结构域比其他物种少20个氨基酸,具有3个CCT家族蛋白签名 序列:36KSSLGPVGLDKML487ITNDGATILKLLEVEHP、73B5QDQEVGDGT包含三个 保守的功能结构域 :赤道结构域、 顶端结构域和中间结构域 ,含有9个保守的 ATP 结合位点分别位于 39-41、 91、 95、 137、 377、 395、 434、 486和488位氨基酸 残基处,6 个蛋白质结合位点分别位于第 1-3、 256、 457-461、
3、463、 525、 527-535 氨基酸残基处；大珠母贝CCT-a与海蜗牛(Aplysia californica)、斑马鱼(Danio rerio)、人类(Homo sapiens)CCT- a推导的氨基酸序列同源性分别为 80.7%、 77.1%、 75.4%。获得CCT-B基因两个转录本,分别长1829bp和2289bp,含有相同的5末端 非编码区105bp,3 末端非编码区分别长591bp和131bp,两个转录本开放阅读框 均为1593bp,编码530个氨基酸,具有3个CCT家族蛋白签名序 列 BBKSTLGPKGMDKILCBBVTNDGATILKSIGIVNPYGQDDEVGDG
4、T包5含三个保 守的功能结构域 :赤道结构域、顶端结构域和中间结构域 ,含有 9个保守的 ATP结合位点分别位于 42-44、92、96、160、387、405、445、488和 490位氨基酸残基处,含有一个DEAD box基序:377ILDEADRSL385,3个蛋白质结合位点分别位 于第1-4、467、526-530氨基酸残基处；大珠母贝CCT-B与牡蛎(Crassostrea gigas)、斑马鱼(Danio rerio)、人类(Homo sapiens)CCT- B推导氨基酸序列同 源性分别是90.4%、76.8%、75.8%。cct- n基因cdna全长1895bp,开放阅读框为
5、1895bp,编码543个氨基酸,cct- n具有3个cct家族蛋白签名序 列 :37rttlgprgmdkli49 、 58isndgatilktldivhp74 、 86qdaevgdgt94, 包含三个保 守的功能结构域 : 赤道结构域、顶端结构域和中间结构域 , 含有 9 个保守的 atp 结合位点分别位于 40-42、 92、 96、 161、 391、 409、 449、 492和 494位氨基酸 残基处,3 个蛋白质结合位点分别位于第 1-4、 250、 543氨基酸残基处 ；大珠母贝 cct- n 与牡蛎(crassostreagigas) 、海蜗牛(aplysiacalifo
6、rnica)、斑马鱼(daniorerio) 、人类 (homosapiens)cct- n 推导的氨基酸序列同源性分别是 83.2%、 81.2%、 80.1%、 79.3%。2.大珠母贝cct- a、cct- B和cct- n基因组织差异表达分析米用实时荧光 定量pcr技术检测了 cct- a、cct- B和cct- n基因mrna在大珠母贝心脏、闭壳 肌、外套膜、鳃、肝胰腺、胃、唇瓣、腹足 8个组织中的表达情况。研究结果显 示,cct- a、cct- B和cct- n在大珠母贝各组织中均有表达。cct- a基因在鳃、外套膜和闭壳肌表达量较高,胃、腹足和唇瓣中表达量较 低，肝胰腺和心脏中表
7、达量最低。cct- B基因在鳃和闭壳肌中表达量亮较高,腹足 和唇瓣次之 , 外套膜、心脏、肝胰腺、胃表达量较低。cct- n基因在闭壳肌中表达量最高,鳃中表达量其次，腹足、外套膜、胃和唇 瓣中表达量较低,肝胰腺和心脏中表达量最低。cct- a、 cct- B和cct- n在大珠母贝闭壳肌和鳃中均有较高表达 ,提示三者在闭壳肌和鳃中具有重要的的生理作 用；而cct- a在外套膜中有较高表达,提示cct- a在外套膜中具有特别重要的作 用。3.冷应激对大珠母贝cct- a、cct- B和cct- n基因表达的影响采用实时荧 光定量pcr技术检测了 20C冷应激条件下24h内cct- a、cct-
8、B和cct- n基因 mrna在大珠母贝组织中的表达情况。结果显示，在低温应激条件下，三种cct基 因表达量均呈现先增高后降低的趋势。cct- a在闭壳肌、肝胰腺、心脏6h时表达量显著上调，12h时仍保持较高的 水平,24h时表达量显著下降至0h时表达水平；而在鳃和外套膜12h时表达量才 显著升高，24h时表达量显著下降至0h时表达水平。cct- B在心脏、肝胰腺中在 6h时表达量升至最高,12h时仍保持较高的水平,24h时回落至0h时水平,而在闭 壳肌、鳃、外套膜12h时表达量显著升高,24h时表达量显著下降至0h时表达水 平。cct- n在闭壳肌中cct- n基因在冷应激后12h时表达量升至最高,24h时回 落至0h时表达水平以下；而在肝胰腺和心脏中cct- n基因在6h时表达量到达峰 值,12h时表达量显著下降,回落至0h时表达水平,24h时表达量维持在此水平。 冷应激后,大珠母贝各组织中CCT-a、CCT-B和CCT-n表达显著上调,但不同组 织的冷应激响应模式不同 , 心脏和肝胰腺响应速度快于其他组织 , 提示冷应激时 CCT-a、CCT-B和CCT-n对保护大珠母贝组织,特别是肝胰腺和心脏等组织具有重要的作用