发酵工程课件第五章.ppt

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1、第五章 发酵工程的灭菌与空气除菌,第一节 常用的灭菌方法与原理 第二节 培养基灭菌工艺 第三节 空气除菌,第一节 常用的灭菌方法与原理,原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使蛋 白质变性酶失活。 使用范围：器皿、双手和实验室、无菌室的环 境灭菌， 不能用于培养基灭菌,一 常见的灭菌方法 （一）化学物质灭菌,灭菌：指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。,常用的灭菌剂,*,（二） 辐射灭菌,原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。 常用：紫外线、X射线和射线。 使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌,（三） 干热灭菌,原理：利用高温对微生物有氧

2、化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。 常用方法：灼烧和电热箱加热，140-180 1-2小时 使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌,（四）湿热灭菌,原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。 常用方法： 水煮常压灭菌：100 饱和蒸汽灭菌：一般121，30min 使用范围：培养基和发酵设备灭菌。,（五）过滤除菌,原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。 方法: 0.010.45 m孔径滤膜， 使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。,二 、 湿热灭菌原理,（一）生物热死动力学（对数残存定律） dN / dt =- K N N：菌体个数（个）

3、 t : 灭菌时间（min） k：反应速度常数（min-1） dN / dt: 菌受热死亡速率(个/min),如何通过实验根据对数残存定律确定某一温度,某一微生物的K ？ 1. K 与菌种的特性有关 相同温度下，微生物越耐热， k值越小； 相同温度下，微生物越不耐热，k值越大。,（二）反应速率常数K,2. K 与灭菌温度有关 K=A e E / RT （阿累尼乌斯方程） Ln K =Ln A- E/ RT A：比例常数 R：气体常数(J/ mol K) T：绝对温度( K) E：杀死细菌所需的活化能（J/ mol）,二、培养基灭菌工艺,（一）培养基灭菌时间的选择 t =1/ k * Ln( N

4、0/ N) 其中 K：一般耐热的细菌芽孢的K值 N0 ：细菌及芽孢数之和 N：10 -3,（二）培养基灭菌温度的选择选择即能达到灭菌要求，又保证营养成分不被破坏的温度,1.培养基营养成分破坏动力学方程 -dC/dt = K C Ln (C/ C0 ) = - K t -dC/dt :营养物降解速度 mol / L h C: 营养物浓度 mol / L K : 营养物降解反应速度常数 1 / s t ：时间( S ),K = A e- E/ RT Ln K =Ln A- E/ RT A：比例常数 R：气体常数(J/ mol K) T：绝对温度( K) E：营养物破坏所需的活化能（J/ mol）,

5、2. 根据实验结果灭菌活化能大于培养基破坏活化能 E E 3. 当温度升高时微生物死亡速度常数比营养物质降解速度常数变化得大 4. 达到相同灭菌效果，T越高，K越大，所需t 越短，采用高温短时（HTST）灭菌效果好,（ 三） 影响灭菌效果的因素 微生物种类：不同的微生物k值不同。 初始菌量：在保持N值不变的前提下，t 与初始菌量N0的对数成正比。 培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性。 传热与混合状况：影响受热均匀度。 培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。 蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。 pH：酸性pH下可加快微生物热死速率。,第二节 培养基灭菌工艺,一、分批灭菌(batch s

6、terilization) 二、连续灭菌(continuous sterilization),一 分批灭菌方法（实验室种子培养基）,手提式灭菌锅结构示意图,立式,台式,卧式,一 分批灭菌(batch sterilization) （一）定义： 将配制好的培养基输入发酵罐中，用蒸汽加热，使培养基和设备同时灭菌的一种灭菌方式。,（二）操作过程： 空罐准备：清洗、检修和检测。 升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。 保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。 冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度。,温度随灭菌时间的变化,三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持

7、一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。,*,四路出汽：直接蒸汽从排气、接种、进料和消沫剂管排气,（三）发酵罐分批灭菌示意图,二、连续灭菌(continuous sterilization) 定义：将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式。 流程： （一）由热交换器组成的灭菌系统 （二）蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统 （三）由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统,由热交换器组成的灭菌系统工艺流程图,温度随时间的变化,蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统,温度随灭菌时间的变化,连消塔喷淋冷却连续灭菌流程,预热至60-70 ,132,40-50,维持数分钟,三、

8、连续灭菌与分批灭菌的比较与选择,分批灭菌 优点： 1不需附加设备 2蒸汽利用率高 3节约劳动力 缺点 1培养基质量比较差 2罐的利用率低 3. 冷却水用量大,连续灭菌 优点： 1 采用高温快速灭菌法 2可以把培养基按其性质分开灭菌 3 有利于自动控制 4 节省冷却水 缺点 1投资费用高 2对物料要求高 3蒸汽用量大,四、培养基灭菌方法选择原则,1培养基成份（易降解成分、液化情况等） 2 设备状况（冷却面积、传动装置等） 3. 动力条件,五、高温对培养基成分的有害影响及其防止,六、消除高温有害影响的措施,采用特殊加热灭菌法(连续灭菌方法） 对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别

9、灭菌后再合并； 对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀； 对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌。,第三节 空气除菌,一 空气净化的方法 二 空气的过滤除菌原理和介质 三 空气净化的流程 四 附属设备,空气中微生物的数量与环境有密切关系。 一般干燥寒冷的北方，空气中含微生物量较少，而湿润温暖的南方空气中含微生物较多； 城市空气中的微生物含量（103-104个/m3）比人口稀少的农村多； 地平面空气中微生物含量比高空多。,空气灭菌的必要性 好氧微生物在培养过程中，其生长、繁殖、代谢均需要大量氧气的参与； 所需氧气通常是以空

10、气的形式提供的； 空气中含大量的各类微生物，如果随空气一同进入培养系统，便会在合适的条件下大量繁殖，与目的菌株竞争性消耗营养物质，并产生各种副产物，从而干扰或破坏纯种培养过程的正常进行，甚至使培养过程彻底失败导致倒罐； 因此空气的灭菌是好氧培养过程中的一个重要环节。,热灭菌法 静电除菌 介质过滤除菌法,一 空气净化的方法,各种不同的培养过程，鉴于其所用菌种的生长能力强弱、生长速率的快慢、培养周期的长短以及培养基中pH值差异，对空气灭菌的要求也不相同。所以，对空气灭菌的要求应根据具体情况而定。 一般可按103的染菌概率，即在1000次培养过程中，只允许一次是由于空气灭菌不彻底而造成染菌，致使培养

11、过程失败。 空气净化的方法大致有以下几种：,1. 热灭菌法,基于加热后微生物体内的蛋白质（酶）热变性而得以实现。,它与培养基的加热灭菌相比，虽都是加热法把微生物杀死，但两者的本质是有区别的。,鉴于空气在进入培养系统之前，一般均需用压缩机压缩，提高压力，所以，空气热灭菌时所需的温度，就不必用蒸汽或其他载热体加热，而可直接利用空气压缩时的温度升高来实现。 空气经压缩后温度可升到200以上，保持一定时间后，便可实现干热杀菌。 利用空气压缩时所产生的热量进行灭菌的原理对制备大量无菌空气具有特别重要的意义。 在实际应用时，对培养装置与空气压缩机的相对位置，连接压缩机与培养装置的管道灭菌以及管道长度等问题

12、都必须加以仔细考虑。,近年来一些工厂已使用静电除尘除去空气中的水雾、油雾、尘埃，同时也除去了空气中的微生物。 静电除菌时是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的。 悬浮于空气中的微生物，其孢子大多数带有不同的电荷，没有带电荷的微粒进入高压静电场时都会被电离成带电颗粒。 对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引力等于或小于微粒布朗扩散运动的动量时，则微粒就不能被吸附而沉降，所以静电除尘灭菌对很小的微粒效率较低。,2. 静电除菌,过滤除菌法是让含菌空气通过过滤介质，以阻截空气中所含微生物，而取得无菌空气的方法。 通过过滤除菌处理的空气可达到无菌，并有足够的压力和适宜的温度以供好

13、氧培养过程之用。 该法广泛应用，是获得大量无菌空气的常规方法，在生产中使用最多。,3. 介质过滤除菌法,按过滤机制的不同,绝对过滤 利用微孔滤膜，其孔隙小于0.5甚至0.1m，将空气中的细菌滤除，从而获得无菌空气。,深层介质过滤 由多种介质组成过滤层，滤层较深，空隙较大，靠静电、扩散、惯性和阻截作用等将细菌截留在滤层中，从而获得无菌空气。,二、空气的深层过滤除菌原理和介质,空气的过滤除菌原理,布朗扩散截留作用 拦截截留作用 惯性撞击截留作用 重力沉降作用 静电吸引作用,空气的过滤除菌原理,在过滤除菌中，有时很难分辨上述各种机理各自所作贡献的大小。 随着参数的变化，各种作用之间有着复杂的关系，目

14、前还未能作准确的理论计算。 一般认为惯性撞击截留、拦截截留和布朗运动截留的作用较大，而重力和静电引力的作用则很小。,气流速度小：布朗扩散截留和拦截截留显著 气流速度大：惯性撞击截留作用显著,空气过滤除菌的介质,用于空气过滤的过滤介质有：,（1）纸类过滤介质 （3）微孔滤膜类过滤介质 （2）纤维状或颗粒状过滤介质,过滤器的结构,（1）深层棉花（活性炭、玻璃纤维）过滤器,深层棉花过滤器是立式圆筒形，内部充填过滤介质，空气由下向上通过过滤介质，以达到除菌的目的。,填充物按下列顺序安装： 金属丝网和麻布的作用是使空气均匀进入棉花滤层。 在充填介质区间的过滤器圆筒外部有装夹套，作用为在消毒时对过滤介质加

15、热，要十分小心控制，温度过高容易使棉花焦化而局部丧失过滤效率，甚至有烧焦着火的危险。 空气一般从下部圆筒切线方向通入，从上部圆筒排出，出口不宜安装在顶盖，以免检修时拆装管道困难。,孔板铁丝网麻布棉花麻布活性炭麻布棉花麻布铁丝网孔板,过滤器上方装有安全阀、压力表，罐底装有排污孔，以便经常检查空气冷却是否完全，过虑介质是否潮湿等情况。 安装介质要求紧密均匀，压紧要一致。 弹簧压紧装置可以保持在一定位移范围内对孔板的一定压力。,（2）平板式纤维纸分过滤器,空气从筒身中部切线方向进入，空气中的水雾沉入筒底，由排污管排出，空气经缓冲层通过下孔板经薄层介质过滤后，从上孔板进入顶盖排气孔排出。,金属丝网和麻

16、布的作用仍是使空气均匀进入滤层。,（3）管式过滤器 （4）接迭式低速过滤器,三、空气净化的流程,空气净化一般是吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤，然后进入空气压缩机。从空压机出来的空气（一般压力在1.96105Pa以上，温度120150），先冷却到适当的温度（2025）除去油和水，再加热到3035 ，最后通过总过滤器和分过滤器除菌，从而获得洁净度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。,（一）、空气净化的一般流程,具有一定压力的空气可以克服空气在预处理、过滤除菌及有关设备、管道、阀门、过滤介质等的压力损失，并在培养过程中能够维持一定的罐压。 因此，过滤除菌的流程必须有供气设备空气压缩机，对空气

17、提供足够的能量，同时还要具有高效的过滤除菌设备以除去空气中的微生物颗粒。 对于其他附属设备则要求尽量采用新技术以提高效率，精简设备流程，降低设备投资、运转费用和动力消耗，并简化操作。,流程的制定要根据具体所在地的地理、气候环境和设备条件来考虑。如在环境污染比较严重的地方要改变吸风的条件（如采用高空吸风），以降低过滤器的负荷，提高空气的无菌程度；在温暖潮湿的地方要加强除水设施以确保和发挥过滤器的最大除菌效率。 要保持过滤器在比较高的效率下进行过滤，并维持一定的气流速度和不受油、水的干扰，则要有一系列的加热、冷却及分离和除杂设备来保证。,这是一个比较完善的空气除菌流程，可适应各种气候条件，能充分分

18、离油水，使空气达到较低的相对适度下进入过滤器，以提高过滤效率。,1. 两级冷却、加热除菌流程,（二）、几种典型的空气净化流程,1. 两级冷却、加热除菌流程,（二）、几种典型的空气净化流程,特点：两次冷却、两次分离、适当加热。,优点：能提高传热系数，节约冷却用水，油水分离得比较完全。,经第一冷却器冷却后，大部分的水、油都已结成较大的雾粒(20 m)，且雾粒浓度较大，故适宜用旋风分离器分离。 第二冷却器使空气进一步冷却后析出较小雾粒(1 m)，宜采用丝网分离器分离，这样发挥丝网能够分离较小直径的雾粒和分离效率高的作用。 通常，第一级冷却到3035，第二级冷却到2025。 除水后，空气的相对湿度仍是

19、100，须用丝网分离器后的加热器将空气中的相对湿度降低至5060，以保证过滤器的正常运行。 尤其适用于潮湿地区，其他地区可根据当地的情况，对流程中的设备作适当的增减。,2. 冷热空气直接混合式空气除菌流程,压缩空气从储罐出来后分成两部分，一部分进入冷却器，冷却到较低温度，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理的高温压缩空气混合，此时混合空气已达到温度为3035，相对湿度为5060的要求，在进入过滤器过滤。,（二）、几种典型的空气净化流程,2. 冷热空气直接混合式空气除菌流程,特点：省去第二冷却后的分离设备和空气再加热设备，流程简单； 利用压缩空气来加热析水后的空气，冷却水用量少。,适用于中等湿

20、含量地区，但不适合空气湿含量高的地区。,（二）、几种典型的空气净化流程,采用高效率的前置过滤设备，利用压缩机的抽吸作用，使空气先经中、高效过滤后，再进入空气压缩机，降低了主过滤器的负荷，所得的空气无菌程度很高。,（二）、几种典型的空气净化流程,3. 高效前置过滤空气除菌流程,4. 利用热空气加热冷空气的流程,利用压缩后的热空气和冷却后的冷空气进行热交换，使冷空气的温度升高，降低相对湿度。 对热能的利用比较合理，热交换器可兼做贮气罐，但由于气气换热的传热系数很小，加热面积要足够大才能满足要求。,（二）、几种典型的空气净化流程,1. 粗过滤器,四、 附属设备,安装在压缩空气机前的过滤器，主要作用是捕集较大的灰尘颗粒，防止压缩机受磨损，同时也可减轻总过滤器负荷。 要求过滤效率要高，阻力要小。 通常有：布袋过滤，油浴洗涤和水雾除尘等。,2. 空气贮罐,消除压缩机排出空气量的脉冲，维持稳定的空气压力 利用重力沉降作用分离部分油雾 热杀菌 贮气,作用,储气罐,储气罐结构,储气罐外形,3. 气液分离器,作用：分离空气中被冷凝成雾状的水雾和油雾粒子。,气液分离器,本章要求,掌握常用的灭菌方法 掌握湿热灭菌的原理 掌握分批灭菌和连续灭菌的工艺 了解空气灭菌的基本方法和无菌空气的质量标准 熟悉介质过滤除菌的机理 掌握空气过滤器的结构 掌握典型的空气除菌流程,