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1、绪论：细胞工程(cell engineering):应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。广义：所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术。狭义：细胞融合和细胞培养技术。细胞学说：细胞是生物结构、功能和发育的基本单位。1902, Haberlandt植物细胞离体培养实验；B族维生素白应用： White等；激动素 的发现：Miller ;单个胡萝卜细胞形成体细胞胚：1958, Steward;最早研究茎尖培养人参：罗士韦。植物细胞工程技术在育种上的应用(简答)：1
2、、快速获得特殊倍性材料：单倍体、三倍体2、克服远缘杂交不亲和性3、克服杂种胚早期夭折 4、导入外源基因5、突变体筛选6、种质资源保存植物胚胎干细胞：茎端分生细胞、形成层分生细胞和薄壁细胞；组织干细胞：分化程度高的一些细胞； 脱分化(dedifferentiation):分化细胞转变为分生状态，形成胚性细 胞团或愈伤组织的现象；脱分化条件：创伤和外源激素第一章：分化(differentiation):导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。脱分化(dedifferentiation):培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生 细胞状态的过程。再分化(rediff
3、erentiation)：离体条件下，细胞脱分化后，无序生长的细胞及其愈伤组织重新进入有序生长再生为个体的过程细胞全能性(cell totipotency): 一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力。全能性差异：植物顶端分生组织细胞较强；完全失去分裂能力的细胞，如细胞核开始解体 的筛管和木质部部分没有。细胞脱分化过程中的生理活动与细胞结构变化：1、细胞质显著变浓，大液泡消失；2、核体积增加并逐渐移位至细胞中央 3、细胞器增加4、其中细胞脱分化的重要特征： 液泡蛋白体的出现，质体转变为原质体 5、细胞开始脱分化的标志：蛋白体的出现，同 时细胞质密度增加。(填空)极性(polarity )
4、是植物细胞分化中一个基本现象;细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志；极性生长的重要原因是细胞内不同方向Ca+梯度分布;植物细胞离体培养再生两条途径是器官发生体和细胞胚胎发生离体培养中器官发生的方式：1、先芽后根，较为普遍；2、先根后芽；3、愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。激素对器官分化的调控：IAA与KT比例高时利于根的形成，低时利于芽的形成；植物多肽PSK可极大加强基本激素的作用效果。体细胞胚白形成：1、从外植体上直接发生。2、经过愈伤组织：诱导形成愈伤组织；胚性化；体细胞胚形成。高浓度 2,4-D可诱导愈伤组织产生；转到低浓度使胚性化。3、细胞悬浮培养的体细
5、胞胚发生；胚性细胞团：成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞。体细胞胚与合子胚的不同： 1、合子胚发育初期有明显的胚柄，体细胞胚只有类似胚柄的 结构；2、子叶不规范；3、体积小；4、干物质含量低；5、含水量高；6、没有休眠第二章：体细胞无性系变异（Somaclonal variation）:经过组织培养循环出现的再生植株变异。组织培养是诱导的主要原因。1、体细胞再生植株的变异；2、花粉植株的无性系变异诱变方式：体细胞人工突变、基因转移、体细胞融合、物理诱变（紫外线、X射线等）和化学诱变（DES、EMS等）嵌合体（mosaic）：同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞体细胞无性系变异的特点（简答）
6、：1、体细胞无性系变异是组培中较普遍现象2、体细胞无性系变异可遗传3、体细胞无性系变异频率显著高于自然突变4、体细胞无性系变异与外植体来源及培养时间有关（填空）分化水平高的组织产生的无性系比分生组织产生的更易变异。获得较高频率的体细胞无性系变异： 以分化程度高的组织或细胞为外植体， 在一定植物激 素浓度下诱导愈伤，并经较长时间的继代培养， 然后诱导分化再生植株， 有可能得到较高频 率的体细胞无性系变异。体细胞变异的细胞遗传学基础（论述）：染色体变异：非整倍体；染色体断裂、缺失、易位、基因重复和突变植物组织和细胞进入离体培养环境后，细胞分裂的不规则性显著增加，导致染色体和 分子水平的变异。最常见
7、是染色体数目变化。离体培养细胞染色体易于断裂原因：细胞离体培养时分裂周期缩短，分裂速度加快，异染色质复制落后于真染色质，形成染色体桥，造成染色体断裂。离体培养细胞异常有丝分裂类型： 1、有丝分裂失败或进行无丝分裂 2、核内有丝 分裂：染色体复制而细胞不分裂 3、核内再复制：DNA复制而染色体不复制 4、有 丝分裂时形成多极纺锤体。转座子活化的影响：1、转座子活化可造成基因表达的广泛变化，因此无性系变异频率才如此之高2、转座子具有使不活动的结构基因活化特点，因此会有显性基因3、转座子还可使多拷贝基因中那些不表达的拷贝活化，提高基因表达的强度，即基因放大。单倍体培养细胞的无性系变异筛选抗性突变细胞
8、株具有高效和容易稳定优越性：隐性突变基因可以表达，大大提高选出抗性细胞株的机率；显著加快了突变体的稳定和纯合过程。第三章：器皿的选择与清洗： 不同规格三角瓶；清洗：自来水洗，烘干，泡酸，自来水洗，去离子水洗，三蒸水洗，烘干（培养材料染菌的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。酸液（洗液）：浓硫酸加重铭酸钾）母液的配制：1、大量元素母液：通常配成10X浓缩液，配1L培养基时加100mL注意：配制时加一个溶解一个，最后加钙2、微量元素母液：通常配成 1000 X浓缩液，配1L培养基时加1mL3、铁盐母液：通常配成 100 X浓缩液，配1L培养基时加10mL ,螯合铁使得培 养基pH升高至68时，铁离子仍
9、保持二价，可被很好地吸收利用过滤消毒方式：0.45或0.22科m微孔滤膜进行过滤，如激素、诱导子等复合灭菌：在充分清洗后（通常流水冲洗几小时），75%酒精灭菌0.5min, 0.1%升汞灭菌5 20min ,消毒剂灭菌后一定要用无菌水充分清洗灭菌方式：1、高压灭菌2、干热灭菌3、过滤灭菌4、药剂灭菌5、火焰灭菌6、熏蒸灭菌： KMnO4+HCHO 实验室灭菌7、紫外灭菌：无菌间及安全柜灭菌激素（脱落酸）：组培中主要用于胚胎或胚状体发育的后期，抑制胚胎的过早萌发，促进胚胎成熟，使胚胎长成形态正常的植株生长素分裂素使用原则：较高浓度的生长素单独或与细胞分裂素结合使用可有效刺激培养细 胞的增殖和连续
10、生长，形成愈伤组织。培养基中KT浓度高于IAA浓度时，培养物形成芽，不形成根；两者浓度大致相等时，只诱导愈伤组织发生，基本没有器官发生；当IAA浓度高于KT时，培养物分化出根，不形成芽。体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis)从植物体细胞培养物中分化胚胎或胚状体的 过程。第四章快繁(rapid propagation)或微繁(micropropagation)技术：利用组培进行快速营养繁 殖的技术快繁的应用价值：1、杂合植物材料的大量繁殖。2、脱毒种苗生产 3、加速繁殖数量有限的特殊种质材料4、单独繁殖雄株或雌株外植体褐变 brooming:褐变原因：植物中含有多酚，创伤会
11、激活多酚氧化酶，将多酚 氧化为棕褐色的醍类， 使得外植体切口发生褐变，并渗透入培养基，严重影响培养物的生长和分化，甚至致其死亡。影响褐变因素：木本植物外植体易褐化，尤其成年树；培养基中过高浓度的无机盐和肌醇会加剧褐变；6-BA和KT有诱导褐化作用；强光和高温会促进褐化。 预防褐变：1、选取酚类含量低的实验材料2、选择无机盐含量低，不加肌醇的培养基 3、在弱光线或黑暗条件下培养4、培养基中加入抗氧化剂：Vc、柠檬酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇和聚乙烯口比咯烷酮( PVP)。5、在培养基中加入 0.5%1% 活性炭，吸附醍类，注意同时提高培养基中激素浓度。6、不断地更换新培养基再生植株方式：1、外植体直
12、接产生不定芽 2、外植体产生愈伤，转移培养后产生胚状体， 再生植株3、外植体产生愈伤，转移培养后分化芽，再生植株。不定芽adventious shoot顶芽和腋芽以外任何其它器官或组织产生的芽组培脱毒方法：1、高温脱毒：病毒和植物细胞对高温耐受力不同。热处理脱毒又称为 温热疗法，分温汤浸渍处理和热风处理两种。2、低温脱毒也称冷冻法3、化学法：2-硫尿喀咤、8-氮鸟喋吟、virazole (病毒口坐)和一些蛋白质与核酸合成的抑制剂，植物病毒鉴定方法：1、指示植物法2、抗血清鉴定法 3、酶联免疫法4、电镜检查法5、 RT-PCR(填空)1、米至道发现低钱离子浓度和过滤消毒的单糖显著促进禾谷类花粉胚
13、的发育，建 立了 N6和改良N6培养基2、欧阳俊闻确立单核中期的小麦花粉最适于产生花粉植株,较 高的培养温度有利于花粉绿苗形成3、卫志明首次指出大麦遭受碳饥饿可大幅度提高花粉胚的产率。4、孙敬三发现花粉中质体 DNA降解引起的质体 RNA和蛋白质的匮乏是白化苗形 成的原因。5、烟草“单育一号”水稻“单丰一号”。单核中晚期至双核早期的花粉最易形成花粉胚或花粉愈伤条件培养基：已经预先培养过花药(或其它离体细胞)的液体培养基游离/、抱子培养(isolated microspore culture),又花粉培养(pollen culture):把小抱 子从花药中分离出来，进行人工培养小抱子分离培养方法
14、：挤压法、散落法和器械法单倍体植株：植物学上通常把具有配子体染色体数目的抱子体叫做单倍体植株单倍体植物在遗传育种上的价值(简答)：1、利用单倍体植物控制杂种分离，加快常规育 种速度2、提高常规育种的选择效率3、利用H系进行基因定位，绘制遗传图心形胚以后的双子叶胚较易培养，球形胚很难培养;ABA可抑制幼胚吸水,使其脱水干燥，发育成熟胚胎拯救：种间或属间杂交时，两个基因组表达不协调，多数情况下胚乳最先败育，胚仍然健康，可通过离体胚培养将杂种幼胚培养成植株，称为胚胎拯救胚乳培养的意义：1、胚乳细胞中储存大量淀粉、蛋白质和脂类，是研究这些产物代谢工程 的理想系统2、完全由薄壁细胞组成的均质组织，是实验
15、形态发生学研究的极好材料。3、胚乳植株-三倍体，高产、优质、果实无籽；三倍体的经济价值：无籽果实；生物量高；品 质好；获得三体以进行基因定位。第五章悬浮培养 Cell suspension culture:将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养 增殖的技术悬浮细胞系：1、悬浮培养物分散性良好，细胞团较小。2、均一性好：细胞形状和细胞团大小大致相同。3、生长迅速悬浮培养细胞的同步化：1、分选法：梯度离心；Ficoll ;流式细胞仪2、饥饿法3、抑制剂 法FdU, HU4、低温处理：低温处理抑制细胞分裂，再把温度提高到正常的培养温度，也 可达到部分同步化。看护培养(nurse cultur
16、e):在固体培养基上置入一块活跃的愈伤组织，再在愈伤组织上放 一小片滤纸，待滤纸润湿后将细胞接种于滤纸上，当培养细胞长出微小细胞团以后，将其肢解转至琼脂培养基上让其迅速生长次生代谢产物secondary motabalate：由初生代谢产物经过一些独特的代谢途径派生出来 的小分子化合物意义：植物次生代谢产物一直是药物和工业原料的重要来源。在保持植物抗逆性、抗病性 和抗虫性及担当信号分子方面起重要作用。植物细胞培养的优势： 可摆脱对植物资源的依赖，保护物种多样性和生态环境药用植物细胞培养步骤：1、诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬浮细胞系2、筛选高产细胞系3、生物反应器中大量培养细胞或细胞团二步
17、法培养：第一步，愈伤培养在生长培养基上使细胞快速增殖。第二步，细胞生长通过 指数生长期后，转移到生产培养基上进行第二步培养，以获得最高次生产物产量。诱导子(elicitor)： 一类能引起植物细胞代谢强度改变或代谢途径改变的物质，主要指生物 来源的化合物，如寡糖、多糖等。第八早原生质体(protoplast)：植物细胞中，除细胞壁以外的成分分离原生质体的方法：1、机械法：叶肉或其它细胞放在高渗的蔗糖溶液中，使细胞发生质 壁分离，原生质体收缩成球形，完全脱离细胞壁。剪碎组织，可释放原生质体。缺点：产量低，无法从分生组织分离原生质体。2、酶法双子叶植物的幼叶、 子叶、根和下胚轴的切段通常被用来制备
18、原生质体;禾谷类植物， 疏松 易碎的愈伤或悬浮培养的细胞是制备原生质体的理想材料酶溶液的配制：为保持释放出的原生质体的活力和膜稳定性，要求酶液满足以下条件：1、酶液渗透压必须与处理细胞的渗透压相似：同一种植物，子叶和下胚轴游离原生质 体时需要的渗透压最高，愈伤次之，胚性悬浮细胞要求最低。可用原生质体培养基做溶 齐山其渗透压合适。2、酶液添加CaCl2 2H2O, KH2PO4和葡聚糖硫酸钾以提高原生 质体膜的稳定性。还可加入AgNO3减少酶解产生的乙烯，加入过氧化物歧化酶减轻02¥由基对细胞膜损伤，从而提高原生质体植板率。3、MES (吗咻乙基磺酸)作为pH缓冲调节剂对于保持酶解物的
19、酸碱环境起缓冲作用，增加原生质体的释放量和稳定 性。4、酶溶液最适 pH范围为5.45.8酶液配好后，过滤灭菌备用。原生质体活力检测方法 （FDA （Fluorescein diacetatq荧光素双醋酸盐）活体染色：FDA 能透过原生质体膜，在内酯酶作用下水解为不能排出的， 累积在质膜内的荧光素。 在荧光显 微镜下观察时，凡发淡绿荧光的都是活的原生质体植物细胞的离体受精过程：1、精细胞分离：三细胞花粉：禾本科与十字花科植物， 花粉中含有一个营养细胞和两个游离在营养细胞的细胞质中的精细胞，为三细胞花粉；二细胞花粉：茄科和百合科植物， 花粉中有一个营养细胞和一个生殖细胞，为二细胞花粉。花粉萌发后
20、，生殖细胞在花粉管中分裂形成两个精子。三细胞花粉，可以直接从成 熟花粉中分离精子； 二细胞花粉，需要先进行花粉的离体培养，待精子形成后，再从花 粉管中分离精子。2、三细胞花粉精细胞分离方法：渗透压冲击法：花粉置于低渗溶液 中，吸水破裂，释放出精细胞。经低速离心，得到精细胞；研磨法：成熟花粉悬浮于适 当溶液中，研磨使花粉破裂，释放精细胞。二细胞花粉花粉精细胞分离方法：离体培养 法：花粉在液体培养基中人工萌发，待形成精细胞后，用渗透压冲击或研磨使花粉管破裂；活体-离体法：先将花粉授在柱头上，花粉萌发并产生精子后，用渗透压冲击法分 离；改进的活体-离体法；3、卵细胞的分离： 可先分离胚囊，从中分离卵
21、细胞也可直接从胚珠中分离卵细胞： 胚囊分离技术-酶解振荡法。生活胚囊的分离方法： 胚珠放在酶液中，酶液：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、蜗牛酶或崩溃酶。酶解-渗透压冲击 法4、卵细胞与 胚囊其它细胞的分离：酶解-解剖法：优点：分离率较高；缺点：酶解若过度或清洗不彻底，会对后期合子培养产生不利影响。第七章体细胞杂交（somatic hybridization）:完全不经过有性过程，只通过体细胞融合制造杂种 的方法。又称原生质体融合（protoplast fusion）:指将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过 人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。胞质杂种（cybrid）:
22、具有一个亲本的细胞核和两个亲本的细胞质的体细胞杂种叫做胞质杂 种1974, Kao 建立 PEG 法异核体（hetrokaryon）:不同来源原生质体融合形成的杂种原生质体。原生质体融合种类：1、对称融合2、非对称融合原生质体融合手段：1、自发融合2、诱发融合第八章（有大题）人工种子（artificial seeds）:广义是在胚状体或一块组织（顶芽、腋芽） 、一个器官（小鳞 茎等）之外加上必要的营养成分 （人工胚乳）后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹 起来，形成的与天然种子相似的颗粒体。1978年.Murashige在第四届国际植物组织细胞培养大会上提出人工种子制作要求： 要求能够同步
23、地、大规模地产生成熟的体细胞胚状体；给胚状体包裹 上高质量的人工种皮；最后解决人工种子的保存和运输问题。胚状体的包埋要求： 包埋剂应当对胚状体无害，成本低廉；要有一定硬度，能保护胚 状体不受损害；应当含有生长激素和防腐剂，有利于胚状体的萌发。好的包埋剂：既能包住体细胞胚，又能保证胚的存活和正常萌发。最好是褐藻酸盐 繁殖体类型：裸露的或休眠的繁殖体；人工种皮包被的繁殖体；水凝胶包埋再包被人工种 皮的繁殖体生产人工种子的意义：1、无性繁殖植物中，有可能建立一种高效快速的繁殖方法，它既 能保持原有品种的种性，又可以使之具有实生苗的复壮效应2、可以对优异杂种种子不通过有性制种而快速获得大量种子，特别是对于那些制种困难的植物更具有主要的适用意义3、对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料如三倍体、非整倍体、工程植物等，有可能通过人工种子在短期内加大繁殖应用4、与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时还避免了种子携带病原菌的危险5、与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运输。存在的问题：体细胞胚诱导及其可能发生变异；人工种皮还存在缺陷；贮藏、发芽技术尚 待解决；人工种子工厂化生产配套设施；种子成本过高等。