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1、实验一 相差显微镜的使用一、实验目的掌握相差显微镜的原理、构造及其使用方法。二、实验用品试剂：蒸馏水或生理盐水。器材：相差显微镜（相差物镜、转盘聚光器、调中合轴望远镜、绿色滤色镜） 、载玻片、 盖玻片、牙签、滤纸条、指甲油。三、实验原理光波有振幅（亮度） 、波长（颜色）及相位（指在某一时间上光的波动所能达到的位置）的不同。当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。 而活细胞和未经染色的生物标本， 因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时， 波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化 （相应发生的差异即相差） ，而这种微小的变化
2、，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。 相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位， 并且利用光的衍射和干涉现象， 把相差变成振幅差（明暗差） ，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。 相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是： 用环状光阑代替可变光阑， 用带相板的物镜 （通常标有PH 的标记） 代替普通物镜， 并带有一个合轴用的望远镜。环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。 相板安装在物镜的后焦面处， 相板 装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。 它
3、除能推迟直射光线或衍射光的相位以外， 还 有吸收光使亮度发生变化的作用。 调轴望远镜是用来进行合轴调节的。 相差显微镜在使用时， 聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上， 必需调节光阑的亮环和相板的环 状圈重合对齐， 才能发挥相差显微镜的效能。 否则直射光或衍射光的光路紊乱， 应被吸收的 光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。1 .相差同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是在某一时间上，光的波动所达到的位置。 一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差太小， 我们 的眼睛很难分辨出这种差别的，只有变相差为振幅差（明暗之差） ，
4、才能被分辨。当光波通 过两种折射率不同的物质时，如由空气f水，或空气玻璃，其波长、振幅和相位均有不同变化。如光波通过1cm厚的水和1cm厚的玻璃时，由于两者折射率不同，通过它们的光波在相位上产生一定的差异。 通过玻璃的光波相位落后， 因为玻璃的密度和折射率比水大， 所以光 波的波长和频率都小于水。 相差决定于光波通过介质的折射率之差及其厚度， 等于折射率与 厚度的乘积之差（光程之差） 。介质越厚或折射率越大光波减速也越大，即相差显微镜就是 利用被检物的光程之差进行镜检的。2 .折射与干扰 肉眼看不见的相差，只要利用衍射和干涉现象，把相差变成明暗的振幅差就可能看见。（ 1 ）衍射波在同一介质里传
5、播是沿直线方向传播， 如果在它传播的方向上， 遇到迎面档住的孔或障碍物不比它的波长大很多， 这次波就会明显地绕到障碍物后面或孔的外面去 （传播路线发生弯曲） ，这种现象叫着波的衍射。（ 2）干涉在同一种媒质里传播的两列波， 如果频率与波长同， 在两列波相交的区域里， 由于叠加的结果，每一点的合振幅都是一定的，并且出现振动加强或减弱， 这就是波的干涉现象。光通过小颗粒的物体后产生直射光和衍射光， 衍射光的光波振幅小， 相位滞后。 在光学系统中，这两种光相遇或光的叠加，振幅发生变化，光线或明或暗，这就是光的干涉现象。 如果物体粒子是折射率稍大于周围媒质的极小的透明体时，由于光程 （折射率与厚度的乘
6、积） 比较大，所以通过粒子的光比周围的光在相位上有所推迟。这是因为被检粒子的衍射光相位比折射光相位大约迟1/4 波长的缘故。 若是在直射光的通过点和大部分的衍射光的通过面放置吸收光的物质或推迟相位的物质时， 就能分别改变直射光和衍射光的相位和振幅。 如果把直射光相位推迟1/4波长，使与衍射光保持同一相位，合成波（P）等于直射光与衍射光的振幅之和（P=S+D ） ，振幅加大，亮度提高。相反地，把衍射光相位推迟 1/4 波长，两者的相差变为1/2 波长，合成波的振幅等于两波的振幅差（P=S-D ） ，这时亮度减弱变暗。光线的相位肉眼是看不见的，但利用衍射和干涉的现象把相位差变为振幅差（明暗反差）就
7、能用肉眼识别。衍射光的相位比直射光推迟1/4 波长，合成波由与两者干涉而生成，形成被检物体的像，振幅与 S 同，相位稍延迟。3 .相板的作用为了达到相差效应， 在相差显微镜的物镜中， 装有由光学玻璃制成的相板。 在圆形相的平面上，有一圈与周围（里外）相板厚度不同的或凸或凹的圆环。相板分两部分：（ 1 ）共轭面：通常为环状，是直射光通过部分。其环是凸起的，也可能是凹陷的。（ 2 ）补偿面：共轭面内外两侧部分，是通过衍射光的部分。在相板的共轭面和补偿面上， 涂有改变光波相位或吸收光线的物质， 当光线通过时， 使光波的相位或振幅改变， 从而达到不同目的的观察效果。 利用相板把光波相位推迟， 振幅改变
8、。相板的作用，除推迟直射光和衍射光的相位之外，还有吸收光，使亮度改变。物镜的后焦点位于透镜中间而相板位于物镜的后焦面上，所以，相板也安装在透镜中间。不同种类的相板对光吸收率不同，产生不同的反差效果，从反差上可分成两大类：（ A ）明反差或负反差：在相差显微镜的视场中，物象亮度大于背景亮度的现象。在被检物体的折射率大于媒质时，被相板的共轭面（因为在共轭面上涂有改变相位和吸收光的物质）推迟1/4波长，同时吸收 80%-90%振幅变小，致使仅由直射光照射的背景变暗。通过补偿面的衍射光没有变化， 由于直射光推迟1/4 波长，两者 （直射光与衍射光） 有完全相同的相位，合成波 P等于直射光（S）与衍射光
9、（D）之和（P=S+D）,故振幅加大。物象是这两种波的合成波造成，即物象等于 P,所以只有直射光照射的背景亮得多。（B）暗反差或正反差：在相差显微镜的视场中，背景亮度大于物象亮度的现象。与明反差相反，把通过补偿面（涂有改变直射光相位的物质）的衍射光推迟1/4 波长，使衍射光与直射光的相位相差1/2 波长，同时，直射光在共轭面（涂有吸光物质）被部分吸收。由于两者在像点相互干涉的结果，使合成波振幅变小，被检物的影象比背景变暗。4 .光路与成像相差显微镜的照明光束， 由转盘聚焦器环状光阑的环状孔射入聚光镜， 投射载物台上的被检样品，经样品后，入射光除投射的直射光外，同时产生衍射光。衍射光的振幅较小，
10、相位滞后直射光和衍射光进入物镜， 前者由环状的共轭面、 后者由较大的补偿面透过相板， 并 相互干涉造像。样品的影象由直射光（ S）和衍射光（D）经干涉后的合成波造成，背景仅 由直射光形成。 由于直射光和衍射光两种光波的相位差异不同造成不同的反差效果， 或明反 差或暗反差不等视所用物镜的相板类型而定。四、装置1 .相差物镜在相差物镜内的后焦面上装有不同的相板， 造成视场中被检样品影象与背景不同的明暗反差。 物镜在明暗反差上可区分为两大类： 即明反差 （ B ） 或负反差 （ N） 物镜和暗反差（ D ）或正反差（P）物镜，标志在物镜外壳上，并兼有高（ H）、中（M）、低（L）等不同反应。有的相差
11、显微镜用 ph 字样表示。相差物镜多为消色差物镜或平场消色差物镜。2 .转盘聚光器由聚光镜和环状光阑构成。环状光阑位于聚光器之下，由不同大小的环状通光孔构成，环状光阑的环宽与直径各不相同， 与不同放大率的相差物镜内的相板相匹配， 不可滥用。 转 盘前端朝向使用者一面有标示窗（孔） ，转盘上的不同部位有0、 1 、 2 、 3 和 4 或 0 、 10 、 20、40 和 100 字样。 0表示非相差的明视场的普通光阑； 1 或 10、 2 或 20、 3 或 30、 4 或 100， 标示与相应放大率的相差物镜相匹配的不同规格的环状光阑的标志。3 .合轴调中望远镜（CT ）又名合轴调中目镜，
12、作为环状光阑的环孔 （亮环） 与相差物镜相板的共轭面环孔 （暗环）的调中合轴与调焦之用。使用时，转盘聚光器的环状光阑与相差物镜必须匹配， 且环状光阑的环孔与相差物镜相板的共轭面环孔在光路中要准确合轴， 并完全吻合或重叠， 以保证直射 光和衍射光各行其道，使成像光线的相位差转变为可见的振幅差。4 .绿色滤色镜从色差的消除情况看，分为多束消色差物镜或PL 物镜。消色差物镜的最佳清晰范围的光谱区 510-630nm 。 欲提高相差显微镜性能最好以波长范围小的单色照明， 故在光路上加用透射光线波长为 500-600nm 左右的绿色滤色镜，使照明光线中的红、蓝光被吸收，只透过绿光，可提高物镜的分辨能力。
13、五、操作1.相差装置的安装相差显微镜区别于普通显微镜的装置主要有相差物镜、 转盘聚光器、 合轴调中目镜和绿色滤色镜四种部件。（ 1）相差物镜的安装从物镜转换器上拆下普通物镜，旋入相差物镜，与普通目镜配套使用。（ 2）转盘聚光器的调换安装旋转聚光器升降螺旋， 把普通明视场聚光器至最低位， 放松固紧螺丝， 卸下普通显微镜使用的聚光器。 把转盘聚光器安放到相应位置上， 旋紧固紧螺丝， 转动聚光器升降螺旋，使升至最高位置。 标示孔朝向操作者。 将环状光阑装在聚光器支架上， 把绿色滤光片放在上面。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。2.聚光器调中转盘聚光器调换安装后，要进行合轴调中，使聚光器的光轴与
14、显微镜的主光轴合一。方法：（ 1 ）旋转集光器转盘的环状光阑，将“0 ”位对准标示孔，使普通聚光器的明视场照明用的普通可变光阑进入光路。（ 2 ）旋转聚光器升降螺旋，升至最高位。（ 3 ）打开光源，使视场明亮。（ 4 ）把被检样品放到载物台上，用低倍（4x ）物镜聚焦。（ 5 ）缩小镜座上的视场光阑开口，至最小。（ 6 ）从目镜观察，在视场中可见一缩小的、明亮的、多角形的视场光阑图象。（ 7 ）转动转盘聚光器的两个调中杆，推动聚光器，把视场中的明亮的多角形的视场光阑图象，调至视场中央。（ 8 ）开放视场光阑至视场同大，两者周边完全重合。否则，重新调中。3 .相板圆环与环状光阑圆环的合轴调中拔出
15、目镜， 插入合轴望远镜，一边从望远镜内观察，并用左手固定其外筒； 一边用右手转动望远镜内筒使其下降， 当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环， 此时可将望远镜固定住。 再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致， 然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮， 使两环完全重合， 如亮环比黑环小而位于内侧时， 应降低集光器使亮环放大；反之，则应升高聚光器，使亮环缩小。如若升到最高限度仍不能完全重合，则可能是载玻片过厚之故，应更换。合轴调整完毕，抽出望远镜，换回目镜，按常规要领进行观察。 在更换不同倍率的相差物镜时， 每一次都要使用相匹配的环状光阑和重新合轴调整。 使用油镜时， 集光器上
16、透镜表面与载玻片之间要同时加上香柏油。 在视场中看见环状光阑为一明亮的圆环，而相板的圆环为一暗环，使用时两者要合轴，互相重叠。方法：（ 1 ） 相差物镜与环状光阑的匹配。如 40x 相差物镜的环状光阑转向 ph3 或 40 ，使相应的环状光阑进入光路。 2） 把CT放入目镜筒。观察视场中明环与暗环图象。 3） 3）聚焦。转动CT 目镜可调部分至清晰地看见明暗环。（ 4 ）与暗环的调中重叠。相板的暗环是固定不动的，处于光路之中，暗环的中心。环状光阑的亮环可调节。4 .相差物镜的选择20XPH=20倍，正反差，反差程度高40XPM=40倍，正反差，反差程度中等100XPL=100倍，正反差，反差程
17、度低40XNH=40倍，负反差，反差程度高40XNM=4嗝，负反差，反差程度中等100XNL=100倍，负反差，反差程度低100XDH=100,暗反差，反差程度高40XDM=4嗝，暗反差，反差程度中等20XDL=20倍，暗反差，反差程度低10XBH=10倍，明反差，反差程度高20XBM=20倍，明反差，反差程度中等40XBL=20倍，明反差，反差程度低相差物镜应用范围标小反差P正观察细胞或细胞内部结构N负观察微小物体如抱子、鞭毛和活的样品H高样品本身反差低的L低样品本身反差高的M1样品本身反差中等的六、实验步骤1.取一张洁净的载玻片，滴一滴生理盐水或蒸储水，用牙签刮自己的口腔粘膜少许与水混匀，
18、 盖上盖玻片。2.10冲目差物镜旋入光路。3 .将相应于10埼目差物镜的聚光器环状光阑移入光路中，完全打开聚光器孔径光阑。4 .将样品置于载物台上，聚焦样品。5 .调节聚光器。6 .观察物镜后焦面，调节环状光阑的像和相板中圆环互相吻合。具体方法：取下一个目镜， 插入聚焦望远镜，转动望远镜的接目镜，直到在望远镜中观察到清晰的环状光阑和相板的像。7 .如果换用高倍相差物镜观察，需要移入相应的高倍聚光器环状光阑，重复以上调节步骤。七、结果与讨论在相差显微镜下观察活细胞，可清楚地分辨细胞的形态，细胞核、核仁以及胞质中存在的 颗粒状结构。八、作业与思考题1 .概述环状光阑的亮环与相板的暗环、合轴、调焦法。2 .用明反差与暗反差物镜分别观察同一物体，阐述其物象的区别。3 .相差显微镜有哪些特有部件，构造如何。4 .明反差与暗反差相板的构成及其原理。5 .相差显微镜的光路图。6 .相差显微镜为什么要用绿色滤色镜。7 .为什么相差显微镜可以直接观察活体样品。